潰瘍性結(jié)腸炎microRNA的差異表達(dá)及microRNA-181a的功能研究.pdf

1、背景:
　　潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)主要表現(xiàn)為粘液膿血便、反復(fù)發(fā)作性腹瀉、腹痛,病變主要位于結(jié)腸的粘膜層和粘膜下層,是一種慢性非特異性的結(jié)腸炎癥,屬于炎癥性腸病(inflammatory boweldisease,IBD)的一種。本病的確切病因不明,多種因素如遺傳、感染、環(huán)境、免疫等在其發(fā)病過程中起到了重要的作用。腸道免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)異常,促炎細(xì)胞因子分泌增多可能是本病的主要發(fā)病機(jī)制,因此探討腸道組織

2、中炎癥相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程有助于闡明UC的發(fā)病機(jī)制。
　　MicroRNA(miRNA)是一類長度為18-24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA(nocoding RNA,ncRNA)。miRNA通過與靶基因3'非翻譯區(qū)(3'UTR)的完全或不完全配對,降解靶基因mRNA或抑制其翻譯負(fù)向調(diào)控基因表達(dá),影響組織和細(xì)胞的功能。miRNA廣泛參與生命過程中一系列重要進(jìn)程,如腫瘤、炎癥、細(xì)胞增殖、凋亡、組織器官的形成等。本研究旨在探討U

3、C中miRNA的差異表達(dá)以及miRNA-181a通過調(diào)控其靶基因TNF-α在UC發(fā)病機(jī)制中的作用,為闡明UC的發(fā)病機(jī)制提供新的理論依據(jù)。
　　目的:
　　對課題小組前期的miRNA芯片結(jié)果進(jìn)行分析,選取在UC患者結(jié)腸粘膜中表達(dá)差異的5種miRNA:miR-181a、miR-181b、miR-182、miR-146a、miR-101,應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR方法進(jìn)行驗證。并探討miR-181a與其靶基因TNF-α在UC患者

4、腸道粘膜炎癥發(fā)展中的作用及機(jī)制,為研究UC的發(fā)病機(jī)制提供新的切入點。
　　方法:
　　1.分析前期miRNA芯片結(jié)果篩選出5種在UC患者結(jié)腸粘膜組織中差異表達(dá)的miRNA:miR-181a、miR-181b、miR-182、miR-146a、miR-101,應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR法進(jìn)一步進(jìn)行驗證。
　　2.選取miR-181a作為進(jìn)一步的研究對象,利用生物信息學(xué)方法預(yù)測miR-181a可能的靶基因為TNF-α。W

5、esternblot法檢測UC患者和健康對照組結(jié)腸粘膜中TNF-α的表達(dá)變化。
　　3構(gòu)建TNF-α3’UTR野生型及突變型載體,應(yīng)用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-181a與TNF-α之間的靶向調(diào)控關(guān)系;過表達(dá)和抑制表達(dá)miR-181a進(jìn)一步檢測TNF-α在蛋白水平的變化。
　　4.過表達(dá)和抑制表達(dá)miR-181a檢測TNF-α及下游IκB的表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1.實時熒光定量RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)在

6、UC患者結(jié)腸粘膜中miR-146a、miR-101表達(dá)上調(diào),miR-181a、miR-181b、miR-182表達(dá)下調(diào)。
　　2.Western blot法顯示UC組結(jié)腸組織中TNF-α蛋白水平的明顯高于健康對照組。
　　3.熒光素酶基因報告實驗顯示miR-181a可顯著降低TNF-α3’UTR野生型組的熒光表達(dá),而轉(zhuǎn)染TNF-α3’UTR突變體組熒光表達(dá)升高;Western blot法顯示過表達(dá)miR-181a組TNF-α

7、蛋白水平的表達(dá)明顯降低。
　　4Western blot法顯示過表達(dá)miR-181a后TNF-α表達(dá)降低而IκB表達(dá)升高;抑制表達(dá)miR-181a后TNF-α表達(dá)升高及IκB表達(dá)降低。
　　結(jié)論:
　　本課題對前期UC的miRNA芯片結(jié)果進(jìn)行了分析,并應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR方法對其中5種miRNA進(jìn)行檢測,在UC患者結(jié)腸粘膜中miR-146a、miR-101表達(dá)上調(diào);miR-181a、miR-181b、miR-1