桑粒肩天牛幼蟲腸道微生物多樣性的分子生物學方法研究.pdf

1、桑粒肩天牛是是鞘翅目天牛科的一個很大的類群，一種重要的農(nóng)業(yè)害蟲，它們危害多種林木和木質(zhì)產(chǎn)品。昆蟲的腸道生活著大量的微生物，這些微生物和宿主相互作用，相互影響，對宿主的生長發(fā)育，營養(yǎng)代謝和疾病防御有著非常重要的作用。依靠純培養(yǎng)技術為基礎的傳統(tǒng)的方法研究腸道微生物的多樣性存在著很多的局限性，因為自然界超過99％的微生物，在現(xiàn)有的實驗條件下都不能培養(yǎng)。而分子生物學的方法能夠突破培養(yǎng)的瓶頸。
　　本試驗使用基于16S rDNA-PCR的變

2、性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)，限制性片段多態(tài)性分析(restriction fragment length polymorphism，RFLP)和均一化克隆文庫技術研究桑粒肩天牛幼蟲腸道微生物多樣性。使用DGGE分析方法，從桑粒肩天牛腸道微生物的16S rDNA擴增片段切膠回收22個不同條帶，經(jīng)過分別測序，顯示出它們屬于15個屬細菌。其中，一株不可培養(yǎng)的變形菌

3、屬菌株（Proteobacterium）和一株克雷伯氏菌屬（Klebsiella）的細菌幾乎都出現(xiàn)在檢測的樣品中。DGGE凝膠中最亮的兩個條帶分別被鑒定為芽孢桿菌屬的菌株（Bacillus sp.）和克雷伯氏菌屬菌株（Klebsiella sp.）。即通過DGGE圖譜表現(xiàn)出來的優(yōu)勢菌為桿菌和克雷伯氏菌。DGGE圖譜還反映了天牛腸道微生物的季節(jié)變化，夏季的腸道菌群較冬季更為豐富。同時，構(gòu)建了一個傳統(tǒng)的桑粒肩天牛幼蟲腸道16S rDNA克隆

4、文庫和一個均一化16S rDNA克隆文庫。用限制性酶切片段多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）方法分析建立的傳統(tǒng)克隆文庫，根據(jù)不同的酶切指紋圖譜將175個克隆子歸為48個不同的分類操作單元（OTUs）。每個分類操作單元選擇一個代表克隆子進行測序，通過比對，這48個OTUs分別屬于22個不同的細菌屬，其中的優(yōu)勢菌是來自克雷伯氏菌屬（Klebsiella），乳球菌屬（Lacto

5、coccus）和腸球菌屬（Entorococcus）的細菌，它們分別占所檢測克隆總數(shù)的24.6%,19.4%和17.1%。此結(jié)果顯示，RFLP分析方法比DGGE分析方法具有更高的分辨率。
　　均一化技術被首次用于環(huán)境中微生物多樣性的研究。在克隆的均一化文庫中，隨機測序的82個克隆包含了79種不同的細菌，它們分別屬于32個屬，17個科和7個門或者亞門。其中，來自醋酸桿菌屬（Acetobacter）,弓形桿菌屬（Arcobacter）

6、,短波單胞菌屬（Brevundimonas）,氫噬胞菌屬（Hydrogenophaga）,克呂沃爾菌屬（Kluyvera）,泛菌屬（Pantoea），Grimontella和涅斯捷連科氏菌屬（Nesterenkonia）等8個屬的細菌在傳統(tǒng)以RFLP方法分析的傳統(tǒng)文庫中和以DGGE直接分析的方法中都沒有檢測到。此外，由于用于分析的序列接近16S rDNA的全長，兩個文庫也提供了比直接的16S rDNA PCR擴增片段的DGGE分析更為詳

7、盡的生物多樣性信息。使用CLUSTAL W和PHYLIP(version3.67)等軟件對所得到的序列進行多樣性分析，發(fā)現(xiàn)在本實驗中得到的部分菌群與基因庫中已知菌群的系統(tǒng)發(fā)育關系較遠，較為獨特。
　　三種分子生物學方法展示了桑粒肩天牛腸道中棲息著超過我們預料的豐富的微生物群體，總共有140多種，來自9個門，22個科和44個屬。這個結(jié)果證明了直接提取DNA和擴增16S rDNA的分子生物學方法比傳統(tǒng)的基于純培養(yǎng)的方法能得到更多的微生