中國(guó)糯玉米多樣性中心及胚乳突變型基因內(nèi)分子標(biāo)記策略研究.pdf

1、關(guān)于中國(guó)糯玉米的起源，國(guó)內(nèi)外學(xué)者做了廣泛研究，雖然大多數(shù)研究者都趨向認(rèn)為糯玉米起源于我國(guó)西南地區(qū)，但也存在很多爭(zhēng)議。澄清糯玉米起源與進(jìn)化問題，不但在其遺傳變異研究領(lǐng)域具有重要的理論意義，同時(shí)對(duì)我國(guó)糯玉米育種實(shí)踐具有重要指導(dǎo)意義。 玉米胚乳突變類型來自普通玉米又優(yōu)于普通玉米，具有較高的遺傳附加值，在育種中占有越來越重要的地位。DNA分子標(biāo)記輔助選擇可避免環(huán)境條件的干擾，直接對(duì)胚乳突變基因型進(jìn)行選擇，提高育種效率。但是，由于分子標(biāo)記

2、與目的基因之間的連鎖不夠緊密，遺傳交換在所難免，選擇效率常比預(yù)想的低。另一方面，SSR、RFLP、AFLP等作物育種中常用的分子標(biāo)記大多位于基因間非表達(dá)序列，一般無法區(qū)別與其連鎖基因的表達(dá)序列差異，而這種差異才是決定育種材料間目標(biāo)性狀差異的主要原因。因此，根據(jù)所選擇的目的基因序列差異，開發(fā)基因內(nèi)選擇標(biāo)記(或稱功能標(biāo)記)，對(duì)單基因以及主效多基因的選擇將更為有效。在人類遺傳疾病分子診斷方面，此類研究已有較多報(bào)道。然而，有關(guān)植物基因內(nèi)選擇標(biāo)記

3、的報(bào)道卻為數(shù)不多，而且有的還是操作煩瑣的RFLP標(biāo)記。 針對(duì)上述科學(xué)問題，本研究采用SSR標(biāo)記、DNA序列分析等方法，進(jìn)行了相關(guān)研究，取得了以下主要研究結(jié)果： 1.根據(jù)糯玉米的糯性受隱性突變基因waxy(wx)控制，wx基因位于第9染色體9.03位置，利用第9染色體SSR標(biāo)記以國(guó)內(nèi)普通玉米自交系18-599為對(duì)照，對(duì)23個(gè)糯玉米地方品種遺傳多樣性和遺傳關(guān)系進(jìn)行研究。在玉米第9染色體處選取22對(duì)擴(kuò)增帶型穩(wěn)定的引物，從供試材

4、料中檢測(cè)出73個(gè)等位基因，每對(duì)引物檢測(cè)等位基因2-6個(gè)，平均3.32個(gè)，平均多態(tài)信息量0.59，平均標(biāo)記索引系數(shù)2.00。分析SSR標(biāo)記在這些材料中的差異程度，明確不同來源糯玉米材料的類群劃分和遺傳關(guān)系。引物只限在第9染色體有效排除了不同染色體遺傳背景對(duì)糯質(zhì)相關(guān)多樣性研究的干擾；多數(shù)引物集中在9.03節(jié)點(diǎn)處，控制了交換所造成的遺傳差異。通過UPGMA聚類分析將24個(gè)材料分為五群，第一群包含兩亞群：第一亞群包括H2(黑河糯)、H3(賓縣糯

5、)、H6(友誼粘)、H8(依蘭縣糯)，第二亞群包括Y2、H13、Y1、Y3、Y4、H11(黑包公)、Y8、Y9、Y10、Y14；第二群：普通玉米對(duì)照18-599；第三群：A2、A1、w11、w4、G49、G50；第四群：H21；第五群：H4、H5。其結(jié)果與其生態(tài)區(qū)域分布、來源等信息基本相符。來自北方地區(qū)的糯玉米地方品種和來自南方的糯玉米地方品種被劃分在同一大群中，又各自劃分為一亞群。這與目前許多研究認(rèn)為中國(guó)的糯玉米起源于南方的觀點(diǎn)不一致

6、。類群劃分的結(jié)果暗示中國(guó)北方可能還存在糯玉米類群，這為糯玉米種質(zhì)擴(kuò)增改良與創(chuàng)新研究提供參考，也將為糯玉米起源進(jìn)化的進(jìn)一步研究提供有用的線索。 2．對(duì)23份北方、26份南方(包含8份四路糯)、2份美國(guó)以及76份全國(guó)糯玉米展示場(chǎng)的糯玉米雜交種進(jìn)行waxy基因的部分片段測(cè)序及特異引物分析表明：(1)四路糯與南方糯玉米材料的waxy基因序列一致性為100％，由此推測(cè)四路糯可能是南方糯玉米生態(tài)類型的祖先；(2)根據(jù)北方和南方部分糯玉米材料

7、的W5、WB、W4擴(kuò)增片段序列比對(duì)分析結(jié)果，南方和北方糯玉米可以分為兩個(gè)糯玉米生態(tài)群；(3)對(duì)北方和南方部分引物擴(kuò)增片段以及NCBI核酸數(shù)據(jù)庫中的30個(gè)普通玉米自交系的Waxy基因序列進(jìn)行比對(duì)、ClustalW排序以及構(gòu)建PhylogeneticTree，從結(jié)果顯示：來源于我國(guó)南方和北方的糯玉米農(nóng)家品種被劃分在同一群中，暗示北方和南方的糯玉米類群可能具有相同的來源。 一些研究者從糯質(zhì)玉米的形態(tài)學(xué)、生理生化學(xué)、遺傳學(xué)以及起源等方面

8、進(jìn)行研究認(rèn)為：四路糯糯質(zhì)玉米具有一系列玉米原始性狀，如籽粒小、半有稃、果穗小、行數(shù)少、多果穗、多分蘗等；它以過氧化物同工酶的第5帶為其標(biāo)記酶帶，而來源于美國(guó)的馬齒(糯質(zhì)馬齒)玉米則以第4帶為標(biāo)記酶帶，兩帶受控于一對(duì)共顯性等位基因，均為綠色組織所特有。公認(rèn)四路糯是中國(guó)糯玉米的祖先。 3．根據(jù)顆粒凝結(jié)型淀粉合成酶基因的外顯子序列，設(shè)計(jì)4對(duì)首尾交疊的特異PCR引物，分段擴(kuò)增19個(gè)糯玉米自交系和2個(gè)普通玉米自交系顆粒凝結(jié)型淀粉合成酶基因

9、的編碼序列及少量側(cè)翼序列。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同糯玉米自交系似基因的突變位點(diǎn)不同，以5’端的插入突變居多，而編碼序列中部的突變較少。根據(jù)顆粒凝結(jié)型淀粉合成酶基因(Wx)與其隱性突變等位基因(wx)之間的序列差異設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)幼苗葉片總DNA樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增。從普通玉米與糯玉米雜交F2代分離群體的130個(gè)單株中，鑒定出97個(gè)陽性單株和33個(gè)陰性單株。不僅x<'2>測(cè)驗(yàn)符合3:1的分離比率，而且用2％I<,2>/KI溶液染色鑒定表明，陽性單株

10、的籽粒全部表現(xiàn)為非糯性，陰性單株的籽粒全部表現(xiàn)為糯性。 4．以玉米02基因?yàn)槟０逍蛄?，選取02基因變異較大的區(qū)域，使用Dnastar軟件設(shè)計(jì)了3對(duì)引物，對(duì)四份高賴氨酸材料02基因部分區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增。測(cè)序結(jié)果表明，02位點(diǎn)隱性等位基因在結(jié)構(gòu)上與野生型等位基因的差異主要表現(xiàn)為核苷酸的替換、缺失和插入，而且差異位點(diǎn)較多，在02基因1436位點(diǎn)的片段差異達(dá)到了25個(gè)堿基。根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)所揭示的1475位點(diǎn)顯性基因O2與其隱性突變等位基因o2