上海地區(qū)小鼠諾瓦克病毒的感染狀況及病毒的分離和表達.pdf

1、小鼠諾瓦克病毒(Murine Noroviruses，MNV)屬于杯狀病毒科，諾如病毒屬，在實驗小鼠中的自然感染率很高，最初是在免疫缺陷小鼠內(nèi)發(fā)現(xiàn)的。感染MNV后，免疫功能正常的小鼠通常無明顯癥狀，而免疫缺陷小鼠可以出現(xiàn)致死性感染。MNV具有遺傳和抗原多樣性，容易發(fā)生變異，我國關(guān)于MNV的報道還比較少，對其致病力及對實驗研究的影響尚不完全清楚，也沒有明確的感染情況調(diào)查。
　　為了解上海地區(qū)實驗小鼠自然感染MNV的狀況，本實驗抽取委

2、托檢測單位送檢的319只SPF級實驗小鼠，分別采集盲腸內(nèi)容物和血清樣本，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法擴增小鼠盲腸內(nèi)容物樣本中MNV的特異性基因片段來檢測MNV的感染狀況，同時采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)與核酸檢測方法進行對比。MNV可以在小鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞內(nèi)進行復(fù)制，并能產(chǎn)生細胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)，

3、利用這個特性，可以將RT-PCR檢測結(jié)果為陽性的盲腸內(nèi)容物樣本稀釋后經(jīng)0.22μm濾膜過濾，將濾液接種到RAW264.7細胞分離病毒，盲傳后采用RT-PCR方法鑒定。MNV是RNA病毒，基因組含有四個開放閱讀框(Open readingframes，ORFs)，其中的ORF2編碼衣殼蛋白VP1，而目前關(guān)于MNV的研究多與VP1有關(guān)，根據(jù)GenBank中登陸的國內(nèi)廣州株序列設(shè)計相關(guān)引物，擴增分離毒株的ORF2，并進行克隆、原核表達，觀察是

4、否有誘導(dǎo)蛋白產(chǎn)生。
　　經(jīng)RT-PCR檢測的319份小鼠盲腸內(nèi)容物樣本中，陽性樣本95份，陽性率為29.78％。對180份經(jīng)RT-PCR檢測的小鼠的血清樣本進行ELISA檢測，陽性樣本70份，陽性率為38.89％。RAW264.7細胞盲傳5代后在24h內(nèi)出現(xiàn)CPE，72h內(nèi)病變逐漸明顯，細胞培養(yǎng)物經(jīng)RT-PCR鑒定，凝膠電泳得到一條187bp的目的條帶，測序結(jié)果與樣本來源一致。
　　經(jīng)RT-PCR擴增得到分離毒株的ORF2片

5、段，測序結(jié)果為1626bp，經(jīng)NCBI的BLAST軟件分析，與登錄的MNV毒株同源性在87％以上。為得到大量穩(wěn)定的目的片段，將ORF2克隆到pMD-18T載體。目的質(zhì)粒與表達載體pET28a雙酶切后連接，將重組質(zhì)粒pET28a-ORF2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，IPTG誘導(dǎo)蛋白表達、鎳瓊脂糖親和層析和陰離子交換層析分離純化目的蛋白，通過SDS-PAGE電泳判斷目的蛋白分子質(zhì)量約60 KD。
　　本實驗通過核酸檢測方法和血清學(xué)