心肌營養(yǎng)素1促進(jìn)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞神經(jīng)分化及MAPK-ERK和PI3K-Akt信號(hào)通路的交互作用.pdf

1、目的：探討心肌營養(yǎng)素1( cardiotrophin1, CT1)對(duì)人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞（humanumbilical cord blood-derived MSCs, hUCB-MSCs)誘導(dǎo)神經(jīng)分化的促進(jìn)作用及MAPK/ERK和PI3K/Ak信號(hào)通路在此過程中是否存在交互作用。
　　方法：(1)hUCB-MSCs分離、培養(yǎng)及鑒定:采集人臍血標(biāo)本，采用改良密度梯度離心法及貼壁篩選法分離培養(yǎng)及純化hUCB-MSCs，采用流式細(xì)胞術(shù)鑒

2、定間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記；（2）腺病毒轉(zhuǎn)染：用Adv-CT1及Adv-EGFP以感染復(fù)數(shù)（MOI）=100PFU/cell分別轉(zhuǎn)染 hUCB-MSCs；（3）神經(jīng)誘導(dǎo)分化：采用神經(jīng)誘導(dǎo)劑（全反式維甲酸、谷氨酰胺及無血清高糖培養(yǎng)基）誘導(dǎo)hUCB-MSCs向神經(jīng)方向分化，于誘導(dǎo)后6h及4d觀察各組形態(tài)學(xué)變化，共聚焦顯微鏡觀察神經(jīng)元特異性核蛋白（NeuN）及膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP）表達(dá)情況；(4)選用不同siRNA濃度(25nM、50nM、

3、100nM)摸索最佳轉(zhuǎn)染效率；（5）用siRNA-ERK及siRNA-Akt以最佳轉(zhuǎn)染效率的siRNA濃度轉(zhuǎn)染神經(jīng)誘導(dǎo)分化后的hUCB-MSCs，用 Western blot技術(shù)檢測基因沉默后各組 ERK、p-ERK、Akt、p-Akt及凋亡相關(guān)蛋白（Bax、Bcl-2）表達(dá)情況。
　　結(jié)果：(1)分離出的單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)原代培養(yǎng)10天左右可見大量破骨樣細(xì)胞及少量呈集落生長的梭形細(xì)胞生長，14天左右可傳P1代，經(jīng)培養(yǎng)3-4天細(xì)胞融合度

4、達(dá)80％-90%可再次傳代，至P3代時(shí)細(xì)胞形態(tài)均一，流式細(xì)胞術(shù)免疫表型檢測結(jié)果顯示，高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志 CD44、CD90、CD73、CD105，不表達(dá)造血干細(xì)胞表面標(biāo)志CD34及單核細(xì)胞表面標(biāo)志CD45。（2）腺病毒以最佳感染復(fù)數(shù)轉(zhuǎn)染72小時(shí)后，CT1能在hUCB-MSCs中穩(wěn)定表達(dá)；（3）神經(jīng)誘導(dǎo)分化6h后，除空白對(duì)照組外，其余各組均出現(xiàn)類神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化（胞質(zhì)向胞核皺縮，并伸出長的突起），CT1組變化更顯著，且CT1組較其

5、余各組相比NeuN表達(dá)量最高（44.23±2.83%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05），隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長，細(xì)胞形態(tài)變化更明顯，交織呈網(wǎng)狀，NeuN表達(dá)量也逐漸增加，誘導(dǎo)4d后CT1組表達(dá)量最高（82.50±4.17%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；誘導(dǎo)6h后，GFAP即有表達(dá)，CT1組表達(dá)量最高（（55.37±3.31%）），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；隨后逐漸增加，誘導(dǎo)4d后CT1組表達(dá)量最高（82.04±3.23%），

6、差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；（4）經(jīng)siRNA轉(zhuǎn)染72h后，濃度為100nM組轉(zhuǎn)染效率最高（91.67±1.74%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）；（5）siRNA-ERK組及siRNA-Akt組的p-EKR、p-Akt、Bcl-2表達(dá)水平較CT1組及siRNA-control組明顯減低，而Bax相對(duì)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。
　　結(jié)論：（1）密度梯度離心結(jié)合直接貼壁可高效分離提取 hUCB-MSCs；（2