柱撐處理對蒙脫石納米微粒吸附霉菌毒素的影響研究.pdf

1、本課題應(yīng)用納米技術(shù),構(gòu)建了蒙脫石納米微粒MN、CTAB-柱撐蒙脫石納米微粒CMN和Al2O3-柱撐蒙脫石納米微粒AMN,并對其進(jìn)行表征。以MN作為對照,系統(tǒng)地研究了柱撐后的CMN和AMN對玉米赤霉烯酮(ZEA)、赭曲霉毒素A(OTA)和黃曲霉毒素(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)的吸附效果及吸附穩(wěn)定性和選擇性；同時(shí),運(yùn)用Caco-2細(xì)胞模型考察了CMN、AMN和上述六種霉菌毒素對Caco-2細(xì)胞的增殖毒性以及CMN和AMN通過吸

2、附對其在Caco-2細(xì)胞模型中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的影響。
　　 主要研究結(jié)果如下：
　　 1.柱撐蒙脫石納米微粒的構(gòu)建與表征 以鈉基蒙脫石、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、AlCl3?6H2O為主要原料,應(yīng)用納米科技,構(gòu)建出蒙脫石納米微粒MN、柱撐蒙脫石納米微粒CMN和AMN,比較研究了MN、CMN和AMN的粒徑大小和晶體結(jié)構(gòu)。 經(jīng)原子力顯微鏡分析,CMN和AMN的粒徑均小于100nm,經(jīng)X衍射譜線和紅外光譜分析,CTAB和

3、Keggin鋁離子以離子交換的方式進(jìn)入蒙脫石結(jié)構(gòu)單元層間,后者再經(jīng)500℃高溫煅燒后,在蒙脫石層間形成Al203氧化物柱。與MN相比,CMN和AMN經(jīng)柱撐后doo1層間距增大,分別增加了0.628nm和0.246nm；粒徑變小,分別降低了24.77nm和20.56nm。 CMN和AMN在分別吸附了ZEA、OTA和AFB1后,形成吸附劑-霉菌毒素復(fù)合物,再進(jìn)行XRD和FTIR分析。XRD分析結(jié)果顯示,CMN在吸附了ZEA、OTA和AFB1

4、后,其doo1層間距分別增加了0.057nm、0.066nm和0.066nm；AMN在吸附了ZEA、OTA和AFB1后,其doo1層間距分別增加了0.005nm、0.036nm和0.02nm。XRD結(jié)果表明,CMN比AMN表現(xiàn)出更優(yōu)異的吸附性能與霉菌毒素分子能夠大量進(jìn)入其層間有關(guān)。FTIR分析顯示,CMN和AMN在吸附霉菌毒素分子時(shí),其層間的烷基碳鏈、Al2O3中的氧原子、霉菌毒素分子結(jié)構(gòu)中的羰基氧原子和不飽和碳-碳雙鍵及碳-氧雙鍵均不

5、同程度地參與其中。
　　 2.柱撐蒙脫石納米微粒對霉菌毒素的吸附研究 從吸附時(shí)間、吸附劑用量、溶液pH、吸附溫度、振蕩速度以及起始濃度等方面研究了CMN和AMN在體外水相溶液中對ZEA、OTA、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2的吸附效果,同時(shí)也考察了CMN和AMN對它們的吸附穩(wěn)定性和選擇性。結(jié)果顯示,經(jīng)過柱撐的CMN和AMN對上述六種霉菌毒素均表現(xiàn)出優(yōu)異的吸附效果,根據(jù)Freundlich等溫方程,CMN和AMN對ZE

6、A、OTA、AFB1、AFB2AFG1、AFG2的飽和吸附容量分別達(dá)到了1830.21μg/g和1034.90μg/g(P0.05)、3663.53μg/g和2466.61μg/g(P0.05)、3112.43μg/g和2087.37μg/g(P0.05)、1479.79μg/g和1210.60μg/g(P0.05)、1882.35μg/g和523.72μg/g(P0.05)、975.89μg/g和905.94μg/g(P0.05)；根

7、據(jù)Langmuir等溫方程,ZEA、OTA、AFB1、AFB2、AFG1、AFG2在CMN和AMN上的飽和吸附容量分別達(dá)到了1250.00μg/g和1428.57μg/g(P0.05)、1111.11μg/g和1250.00μg/g(P0.05)、1428.57μg/g和1666.67(P0.05)、1111.11μg/g和1111.11μg/g、1250.00μg/g和1250.00μg/g、1000.00μg/g和1111.11μg

8、/g(P0.05)；而未經(jīng)柱撐處理的MN的飽和吸附容量根據(jù)Freundlich和Langmuir等溫方程分別達(dá)到了199.34μg/g和555.56μg/g、149.14μg/g和333.33μg/g、1666.67μg/g和1100.27μg/、393.01μg/g和2500.00μg/g、714.29μg/g和258.64.00μg/g、250.09μg/g和1000.00μg/g。與MN相比,有機(jī)或無機(jī)柱撐均使CMN和AMN對六種

9、霉菌毒素的飽和吸附容量顯著提高(P0.05)。 吸附穩(wěn)定性和選擇性研究結(jié)果顯示,CMN和AMN對上述六種霉菌毒素均具有很強(qiáng)的吸附穩(wěn)定性和選擇性,屬于化學(xué)吸附,解吸率均在6.0-20.0％范圍內(nèi),賴氨酸、蛋氨酸、維生素B1、維生素B2、Ca2+和Fe2+等主要飼料養(yǎng)分均未對霉菌毒素的吸附產(chǎn)生顯著影響(P0.05)。CMN和AMN對六種霉菌毒素的吸附速度快,60分鐘內(nèi)即可達(dá)到平衡；pH降低和溫度升高均有促進(jìn)其吸附霉菌毒素的趨勢(P0.05)

10、。
　　 3.柱撐蒙脫石納米微粒和霉菌毒素對Caco-2細(xì)胞增殖的影響 采用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù),以Caco-2為評價(jià)細(xì)胞系,通過MTT法研究了CMN、AMN、ZEA、OTA、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2對Caco-2細(xì)胞增殖的影響,同時(shí)也考察了添加不同劑量的CMN或AMN對霉菌毒素?fù)p傷Caco-2細(xì)胞的影響。 結(jié)果顯示：在霉菌毒素添加劑量為250ng/ml、500ng/ml、750ng/ml、1000ng/ml和暴露

11、時(shí)間為12h、24h、36h、48h的情況下,六種霉菌毒素均顯著降低了Caco-2的相對存活率,在較低濃度和較短的暴露時(shí)間里,其對Caco-2細(xì)胞的增殖毒性具有明顯的量效關(guān)系。 在CMN和AMN的添加劑量為0.25％、0.5％、0.75％、1.0％和暴露時(shí)間為24h、48h、72h的情況下,Caco-2的相對存活率均在88.76％以上；毒性評級結(jié)果顯示,CMN和AMN對Caco-2的毒性級別僅為1級,符合中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)對人體植入

12、材料的細(xì)胞毒性不大于1級的規(guī)定,可以用于霉菌毒素在Caco-2細(xì)胞模型的轉(zhuǎn)運(yùn)研究。 在六種霉菌毒素濃度均為900 ng/ml的細(xì)胞培養(yǎng)液中,依次添加質(zhì)量百分比濃度為0.25％、0.5％、0.75％和1.0％的CMN和AMN,暴露時(shí)間為48h，CMN和AMN均能在各個(gè)添加劑量顯著提高Caco-2的相對存活率(P0.05)。與添加ZEA的陽性對照相比,二者在不同添加劑量對Caco-2細(xì)胞相對存活率的提高幅度分別達(dá)到95.2％、101.9％、

13、103.4％、104.8％和55.1％、62.1％、65.6％、72.5％；與添加OTA的陽性對照相比,二者對Caco-2細(xì)胞相對存活率的提高幅度分別達(dá)到123.9％、137.3％、142.5％、145.4％和80.2％、88.9％、95.0％、104.3％；與添加AFB1的陽性對照相比,二者對Caco-2細(xì)胞相對存活率的提高幅度分別達(dá)到865.7％、902.5％、917.4％、942.8％和646.5％、680.6％、700.8％、7

14、70.0％。與添加AFB2的陽性對照相比,二者對Caco-2細(xì)胞相對存活率的提高幅度分別達(dá)到716.5％、746.4％、761.7％、771.2％和602.5％、617.9％、640.5％、670.4％。與添加AFG1的陽性對照相比,二者對Caco-2細(xì)胞相對存活率的提高幅度分別達(dá)到796.4％、833.5％、843.2％、860.9％,和640.6％、600.0％、708.5％、739.1％。與添加AFG2的陽性對照相比,二者對Cac

15、o-2細(xì)胞相對存活率的提高幅度分別達(dá)到605.4％、617.3％、634.7％、646.6％和508.5％、521.6％、537.4％、564.1％。 結(jié)果顯示,在處于高水平霉菌毒素暴露的環(huán)境下,CMN和AMN通過吸附霉菌毒素均能有效降低其對Caco-2細(xì)胞的損傷。
　　 4.柱撐蒙脫石納米微粒對霉菌毒素在Caco-2細(xì)胞模型中轉(zhuǎn)運(yùn)的影響 應(yīng)用Caco-2細(xì)胞吸收模型,研究了CMN和AMN在模擬消化道環(huán)境中對六種霉菌毒素跨膜轉(zhuǎn)

16、運(yùn)的影響。試驗(yàn)組AP側(cè)六種霉菌毒素的濃度均為900 ng/ml,CMN和AMN的質(zhì)量百分比濃度均為0.25％,37℃培養(yǎng)3h,從Caco-2細(xì)胞模型的BL側(cè)移取200μl樣品液進(jìn)行HPLC分析,計(jì)算各霉菌毒素的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)率。
　　結(jié)果顯示：與對照組相比,CMN分別使ZEA、OTA、AFB1、AFB2、AFG1和AFG2在Caco-2細(xì)胞單層中的轉(zhuǎn)運(yùn)率下降了90.78％、93.68％、91.37％、87.95％、90.72％和87