不結(jié)球白菜BcRISP1的功能分析.pdf

1、細(xì)胞質(zhì)雄性不育系作為雜交育種的重要材料，其分子機(jī)理的研究對(duì)花粉發(fā)育及細(xì)胞質(zhì)遺傳等問(wèn)題的探究具有重要作用。細(xì)胞色素C還原酶鐵硫蛋白(RISP)是線粒體電子傳遞鏈多酶復(fù)合物的一個(gè)亞基，它催化電子從輔酶Q傳給細(xì)胞色素C。RISP在線粒體呼吸鏈中的作用是完全必要的，其為線粒體產(chǎn)生能量用于生物體各項(xiàng)生命活動(dòng)提供重要保障。對(duì)不結(jié)球白菜BcRISP1基因的功能研究有助于進(jìn)一步了解不結(jié)球白菜胞質(zhì)雄性不育發(fā)生的機(jī)理。本實(shí)驗(yàn)利用不結(jié)球白菜差減雜交庫(kù)分析不育

2、系與保持系的差異，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞色素C還原酶鐵硫蛋白基因BcRISP1在不育系和保持系中的表達(dá)有差異，于是設(shè)計(jì)引物，克隆獲得BcRISP1基因全長(zhǎng)。通過(guò)酵母雙雜交篩選互作基因并驗(yàn)證，亞細(xì)胞定位及轉(zhuǎn)基因驗(yàn)證，明確了BcRISP1基因的表達(dá)與不結(jié)球白菜雄性不育的相關(guān)性。
　　主要研究結(jié)果如下:
　　1.從不結(jié)球白菜抑制消減cDNA文庫(kù)中克隆出一條BcRISP1基因，是細(xì)胞色素C還原酶鐵硫蛋白家族的成員之一。BcRISP1序列全長(zhǎng)810

3、 bp，編碼269個(gè)氨基酸，同時(shí)含有一個(gè)細(xì)胞色素C還原酶跨膜域(Ala77-Asp141)和一個(gè)Rieske[2Fe-2S](Val170-Lys266)結(jié)構(gòu)域。通過(guò)氨基酸比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與其他物種的RISP家族具有很高的同源性。熒光定量PCR表明BcRISP1基因在不育系花蕾的孢原細(xì)胞階段高表達(dá)。亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)BcRISP1主要定位在細(xì)胞膜和細(xì)胞核上。因此，推測(cè)BcRISP1在Pol CMS不育系中可能起一定的作用。
　　2.利用G

4、ateway技術(shù)構(gòu)建了植物過(guò)量表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌侵染擬南芥，篩選陽(yáng)性苗進(jìn)行功能分析。表型分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的種子數(shù)減少，種莢數(shù)及種莢的大小也小于野生型擬南芥。實(shí)時(shí)定量PCR發(fā)現(xiàn)線粒體呼吸鏈相關(guān)基因COX10和RIP1表達(dá)量上調(diào)，而QCR7和SDH2-1基因表達(dá)量下降。同時(shí)BcRISP1基因過(guò)表達(dá)會(huì)減少花粉的形成并抑制花粉管的萌發(fā)。這就表明BcRISP1基因的過(guò)表達(dá)會(huì)影響轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的育性。
　　3.從不結(jié)球白菜Pol胞

5、質(zhì)雄性不育花中提取總RNA，通過(guò)長(zhǎng)距離PCR，擴(kuò)增雙鏈cDNA(ds cDNA)。利用SMART技術(shù)，通過(guò)同源重組的方法，在酵母菌株Y187中構(gòu)建了不結(jié)球白菜Pol胞質(zhì)雄性不育花的全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)。經(jīng)檢測(cè)，文庫(kù)的轉(zhuǎn)化率為1.80×106轉(zhuǎn)化子/3μg pGADT7-Rec，文庫(kù)滴度為1.21×107 cfμ/mL，重組率為94％。利用酵母雙雜技術(shù)，篩選出與BcRISP1基因互作的基因CYP81G和PIP2。通過(guò)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化和熒光雙分子互補(bǔ)