不結(jié)球白菜株型性狀相關(guān)基因挖掘及分析.pdf

1、白菜類作物隸屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica)，原產(chǎn)自我國，栽培歷史悠久且品種豐富，主要包括大白菜（Brassica rapa ssp.pekinensis）、不結(jié)球白菜(B.rapa ssp.chinensis; Non Heading Chinese Cabbage; NHCC)和蕪菁（B.rapa ssp.rapa）。其中，不結(jié)球白菜是我國長江中下游廣泛種植的大眾蔬菜。不結(jié)球白菜包含了多個變種，具有豐富的

2、形態(tài)多樣性。在多個變種中，存在不同的株型性狀，如直立、半塌地和塌地。而在直立株型中，又包含直立不束腰和直立束腰株型。在本試驗中，利用簡化基因組測序技術(shù)對直立束腰和半塌地品種雜交構(gòu)建的F2分離群體進行測序，同時利用轉(zhuǎn)錄組和MeDIP測序技術(shù)對束腰品種進行束腰前后的株型差異基因挖掘。根據(jù)測序結(jié)果，對候選基因中生長素信號途徑中的Aux/IAA及ARF家族在大白菜中進行鑒定和進化分析;對脫落酸信號途徑中的SnRK2基因家族在不結(jié)球白菜中進行克隆

3、和分析。主要研究結(jié)果如下:
　　1.使用直立束腰品種和半塌地品種進行雜交，構(gòu)建F2分離群體，來進一步測量束腰性狀及其與其它性狀之間的關(guān)系。結(jié)果證明，束腰性狀并非質(zhì)量性狀，而是在植株成長過程中逐漸形成的數(shù)量性狀。在兩個組合的F2分離群體中，通過測量計算植株的腰粗和菜頭粗的比值得到的束腰比呈正態(tài)分布。并且，植株的束腰比與植株的株高、葉柄長呈負相關(guān)。在束腰形成過程中，與低溫處理的植株相比，處于18℃-24℃環(huán)境中的植株幾乎不束腰，這說明

4、低溫積溫與束腰性狀的形成有關(guān)。
　　2.以大白菜基因組為參考基因組，對兩個株型性狀表現(xiàn)極端的親本構(gòu)建的F2分離群體進行簡化基因組測序，共獲得78，723，756條有效reads，GC含量約42％，終獲得具有1個或多個等位基因的SLAF標簽62，978個，整體平均深度達414.26x，且SLAF標簽在染色體上分布均勻。實驗中定位到了3個較可靠區(qū)域，包含8810個SNP標簽，148條候選基因。根據(jù)不結(jié)球白菜變種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選到25條

5、表達差異較大的基因，其中11條是F-box基因。選定的25條基因在束腰形成前后的樣品中表達差異較大。
　　3.利用轉(zhuǎn)錄組測序和MeDIP測序方法，對不結(jié)球白菜束腰前后的基因進行全面系統(tǒng)的分析。在本研究中，轉(zhuǎn)錄組共得到103，846，926個高質(zhì)量的雙末端序列，比對到參考基因組上的大概約70％，得到上調(diào)差異基因1560條，下調(diào)基因1228條。MeDIP測序共測得223，380，998個長為49bp的雙末端序列，與參考基因組的比對率分

6、別是78.01％和78.13％。測序結(jié)果表明，在束腰過程中，基因組甲基化水平提高。兩種測序聯(lián)合分析后，共鑒定出基因主體負相關(guān)的基因123條，啟動子負相關(guān)基因387條。其中代謝相關(guān)途徑、次生代謝途徑、植物激素轉(zhuǎn)導途徑以及植物病原互作途徑所占比例較高。最終在植物激素信號轉(zhuǎn)導途徑中共選出14條候選基因并進行實時定量PCR驗證。
　　4.在不結(jié)球白菜束腰性狀的轉(zhuǎn)錄組及甲基化聯(lián)合分析中，鑒定出部分生長素響應基因Aux/IAA及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子基

7、因ARF。本研究在大白菜中共鑒定出52條Aux/IAA和33條ARF基因，其中包括1條ARF類似基因，命名為AL。這些基因分化時間與大白菜三倍化時間基本一致。在全基因組加倍后，Aux/IAA基因被全部保留下來，遠優(yōu)先于ARF基因。在陸地植物進化過程中，ARF基因擴增平緩穩(wěn)定，Aux/IAA基因家族擴增迅速且受到的選擇壓力較小。Aux/IAA基因家族表現(xiàn)出了更強的組織表達特異性，重復基因的功能發(fā)生了分化。在研究中鑒定出的AL基因廣泛存在于

8、植物中，并與ARF關(guān)系更近。
　　5.轉(zhuǎn)錄組及甲基化聯(lián)合分析中的候選基因SnRK2.6屬于SnRK2基因家族。本研究結(jié)果表明該家族在進化過程中被優(yōu)先保留，并在不結(jié)球白菜逆境文庫中克隆到13條SnRK2基因。這些基因多數(shù)含有8個外顯子，結(jié)構(gòu)保守穩(wěn)定。大部分基因，尤其是第三亞組參與了ABA調(diào)控。除此之外，大部分基因還可響應冷處理。BcSnRK2.6a則是唯一可同時響應ABA與低溫的BcSnRK2。BcSnRK2的表達模式說明其協(xié)同參與