VEGF-BSA-PCL-PEG同軸納米纖維緩釋載體的構(gòu)建及體外血液相容性和生物學(xué)活性的研究.pdf

1、第一部分:VEGF-BSA/PCL-PEG同軸納米纖維緩釋載體的構(gòu)建
　　【目的】:以聚己內(nèi)脂(PCL)為材料,采用同軸靜電紡絲法制備出VEGF-BSA/PCL-PEG芯殼結(jié)構(gòu)的納米纖維,考察電壓對(duì)纖維結(jié)構(gòu)及直徑的影響規(guī)律。
　　【材料和方法】:同軸靜電紡絲的殼層溶液是以氯仿和乙醇(v/v,60:40)為溶劑的聚己內(nèi)酯溶液,聚己內(nèi)酯的濃度為0.1g/ml,另外每毫升溶液加入0mg,1mg,10mg,20mg的聚乙二醇,聚乙二

2、醇是一種致孔劑,可以加快芯層結(jié)構(gòu)物質(zhì)的釋放。芯層溶液是以PBS為溶劑,溶質(zhì)是牛血清蛋白(BSA)和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF),牛血清蛋白為穩(wěn)定劑,牛血清蛋白和內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的濃度分別為0.01g/ml和10μg/ml。待溶液完全溶解后,分別注入注射器,在常溫下,芯層以0.5ml/h,殼層以2ml/h,分別在15kv,16kv,17kv,18kv下進(jìn)行靜電紡絲,制備VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維。室溫下真空干燥箱下干燥24h,然后放

3、40C冰箱備用。
　　【結(jié)果】:將分別在15kv,16kv,17kv,18kv制的VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維在掃描電子顯微鏡(SEM)下進(jìn)行檢測(cè)。觀察其形貌特征,并用Image-J軟件隨機(jī)計(jì)數(shù)30根纖維的直徑,結(jié)果顯示隨著電壓的增大,纖維的直徑也略微增大。將16kv下的VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維在投射電子顯微鏡(TEM)下檢測(cè),可以觀察到明顯的芯殼結(jié)構(gòu)。
　　【結(jié)論】:成功的構(gòu)建出了攜帶VEGF的

4、VEGF-BSA/PCL-PEG具有芯殼結(jié)構(gòu)的納米緩釋載體。
　　第二部分:VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維緩釋BSA和VEGF的研究
　　【目的】:探究應(yīng)用同軸靜電紡絲法制備出VEGF-BSA/PCL-PEG同軸納米纖維緩釋VEGF和BSA的可行性,根究不同階段測(cè)得VEGF和BSA的濃度,繪制出時(shí)間-累積釋放量(％)曲線圖,探究其釋放規(guī)律。并檢測(cè)釋放出來的VEGF的生物學(xué)活性。
　　【材料和方法】:用同軸靜電

5、紡絲法制的BSA/PCL,BSA/PCL-PEG(100/1,m/m),BSA/PCL-PEG(10/1,m/m),BSA/PCL-PEG(5/1,m/m),將以上每組各5個(gè)試件放入盛有4ml的1×PBS溶液6孔板中,并放入370CO2溫育箱中,在第1,3,7,15,30天取出2ml溶液檢測(cè)BSA的濃度,在將其用新鮮的1×PBS溶液補(bǔ)充到4ml,根據(jù)BCA蛋白定量的方法檢測(cè)取出來的溶液濃度,并根據(jù)濃度繪制出時(shí)間-累計(jì)釋放量(%)曲線,再

6、用同樣的方法制備出VEGF-BSA/PCL-PEG(5:1,m/m),根據(jù)上述的方法用VEGFELISA試劑盒檢測(cè)VEGF的濃度,根據(jù)濃度繪制出時(shí)間-累計(jì)釋放量(%)曲線圖。將第1,3,7天釋放出來的VEGF根據(jù)其濃度調(diào)整到1ng/ml,加入到1×104濃度的內(nèi)皮細(xì)胞中,3天后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),繪制出其細(xì)胞增殖率直方圖,并以空白和新鮮的VEGF作為對(duì)照,并比較它們的生物學(xué)活性。
　　【結(jié)果】:BSA/PCL,BSA/PCL-PEG(1

7、00/1,m/m),BSA/PCL-PEG(10/1,m/m),BSA/PCL-PEG(5/1,m/m)中的BSA在第一天都小的集中釋放,BSA/PCL中的BSA釋放量在30天內(nèi)不到60%,而BSA/PCL-PEG(100/1,m/m),BSA/PCL-PEG(10/1,m/m),BSA/PCL-PEG(5/1,m/m)在30天內(nèi)釋放連都到達(dá)90%以上,PEG可以加速其釋放。VEGF-BSA/PCL-PEG(5:1,m/m)中的VEGF

8、在30天的時(shí)間內(nèi)逐漸釋放,30天的累積釋放量為98%。釋放出來VEGF的生物學(xué)活性與新鮮的VEGF相比沒有顯著性差異(p>0.05)。
　　【結(jié)論】:VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維可以緩釋VEGF和BSA,在體外實(shí)驗(yàn)中可以持續(xù)30天,同時(shí)釋放出來的VEGF生物學(xué)活性沒有發(fā)生變化。
　　第三部分:VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維體外血液相容性和生物學(xué)活性的研究
　　【目的】:評(píng)價(jià)VEGF-BSA/PCL

9、-PEG(5:1,m/m)同軸靜電紡絲膜的物理特性,體外血液相容性和生物學(xué)活性,探求其作為人工心血管替代材料的可行性
　　【材料和方法】:通過靜電紡絲技術(shù)制備VEGF-BSA/PCL-PEG(5:1,m/m)同軸靜電紡絲膜,然后進(jìn)行體外溶血實(shí)驗(yàn),動(dòng)態(tài)凝血實(shí)驗(yàn),凝血時(shí)間測(cè)定,血小板黏附實(shí)驗(yàn),細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),體外細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)對(duì)其血液相容性和生物學(xué)活性進(jìn)行評(píng)價(jià),并與Dacron作平行對(duì)照。
　　【結(jié)果】:VEGF-BSA/PCL-P

10、EG納米纖維的體外外溶血實(shí)驗(yàn),動(dòng)態(tài)凝血實(shí)驗(yàn),凝血時(shí)間測(cè)定,血小板黏附實(shí)驗(yàn)與Dacron相比無顯著性差異(p>0.05),用CCK8檢測(cè)方法對(duì)VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維體進(jìn)行毒性檢測(cè),其相對(duì)增殖率(RGR)>90%,表明細(xì)胞的增長(zhǎng)沒有受到抑制,說明為VEGF-BSA/PCL-PEG納米纖維無細(xì)胞毒性的。
　　【結(jié)論】:VEGF-BSA/PCL-PEG(5:1,m/m)同軸靜電紡絲膜血液相容性較高,于Dacron相當(dāng),且