蓖麻油抗雌鼠生育作用活性物質(zhì)的分離、分析及作用機理研究.pdf

1、鼠害是農(nóng)業(yè)生物災(zāi)害中的主要災(zāi)種之一，是當(dāng)今世界性災(zāi)害，給農(nóng)業(yè)、林業(yè)、畜牧業(yè)等造成了巨大的經(jīng)濟損失。有效控制鼠害是保障農(nóng)林牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，國內(nèi)外鼠害防治以化學(xué)防治為主，主要是通過增加鼠的死亡率來控制害鼠的種群數(shù)量，但均無持效性，且滅鼠后的低密度時間最長僅維持一年左右，此后鼠密度逐漸上升而恢復(fù)至原有水平；傳統(tǒng)滅鼠劑還存在對環(huán)境和其它生物有毒副作用和成本高等弊端。鑒于傳統(tǒng)滅鼠措施存在的不足，一種新的鼠害控制策略逐漸受到重視，即

2、從保持生態(tài)平衡的角度出發(fā)，尋求一種控制鼠類出生率的植物性不育劑，通過降低鼠類群體的繁殖率而實現(xiàn)降低群體密度，從而達到從根本上控制鼠害的目的，且對人類和其他動物、環(huán)境安全無害，效果持久。 有關(guān)不育對鼠類種群繁殖力和數(shù)量影響的研究表明：不育能夠取得滅殺的效果，若考慮不育的干擾作用，不育方法比滅殺更能控制鼠類種群數(shù)量的增加；單性不育控制鼠害的實驗表明，雌性不育比雄性不育效果好，而雙性不育比單性不育效果更好。在近年來興起的植物不育劑的研

3、究和開發(fā)中，許多植物源不育劑是針對抗雄鼠生育的，而抗雌鼠生育的植物不育劑的研究和開發(fā)卻較少見。其主要原因是在雌性不育劑有效成分的研發(fā)過程中，作為導(dǎo)向分離的篩選靶標較難確定，造成篩選抗生育有效成分難度比較大。 蓖麻油是大戟科植物蓖麻(Ricinus communis L.)種子的乙醚提取物(AEC)。在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，蓖麻油具有瀉下通滯、消除癰疽腫毒、導(dǎo)瀉等功能；臨床上用蓖麻油抄雞蛋進行催產(chǎn)已有多年的歷史；在印度、朝鮮、約旦等國和

4、一些非洲國家，婦女常常服用蓖麻籽及其提取物來進行避孕。有研究表明，蓖麻油具有抗雌鼠和雄鼠生育的作用，且其抗生育活性較強。為了研制新型的鼠類不育劑，本研究對蓖麻油抗雌鼠生育作用和作用機理進行了研究，建立了抗雌鼠生育活性物質(zhì)的體外篩選方法，導(dǎo)向分離出具有較強抗雌鼠生育活性的晶體物質(zhì)，并對這一抗雌鼠生育活性晶體物質(zhì)進行了分析。本論文研究的結(jié)果既為開發(fā)高效、安全的植物源抗鼠生育藥物提供有效藥源，又為我國蓖麻資源的綜合利用開辟了新途徑，有利于提高

5、蓖麻產(chǎn)業(yè)經(jīng)濟效益與社會效益；有利于為創(chuàng)制與環(huán)境相容的高效植物源生物鼠不育劑、開發(fā)出具有我國自主知識產(chǎn)權(quán)的新型植物源農(nóng)藥，奠定堅實的理論基礎(chǔ)。本論文主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1、通過用蓖麻油在特定的時間內(nèi)連續(xù)灌胃小鼠，統(tǒng)計懷孕和胚胎數(shù)量，研究蓖麻油的抗早孕、抗著床作用。結(jié)果表明：20 mg/kg/d處理組小鼠受孕率降低不明顯，但是小鼠所孕胎兒總數(shù)有一定的減少；40 mg/kg/d及其以上濃度的兩個處理濃度小鼠受孕率明顯降低，其生育

6、抑制率分別達到：72.2％、88.2％和90％(與對照組比較，p<0.01)，個體所孕的胎兒數(shù)也明顯減少；蓖麻油對小鼠的生育抑制作用有一定的量.效關(guān)系：在抗著床方面，40mg/kg/d、80mg/kg/d和160 mg/kg/d三個處理組的子宮內(nèi)著床位點明顯減少，著床率明顯降低，分別為：3/8、1/6和1/6；在抗早孕方面，從40 mg/kg/d處理濃度開始，小鼠懷孕率明顯降低，生育抑制率顯著提高；小鼠懷孕的胎兒數(shù)隨著處理濃度的增加而減

7、少；此外，蓖麻油處理組卵巢和免疫系統(tǒng)主要的器官脾和腎上腺指數(shù)變化不明顯，但從40 mg/kg/d處理濃度開始，小鼠胸腺增大、胸腺指數(shù)增加。隨著處理濃度的加大，胸腺指數(shù)增加得越顯著(p<0.01)。 2、采用灌胃蓖麻油后對小鼠動情周期、妊娠相關(guān)蛋白-A(pregnancy- associated plasma protein A，PAPP-A)和雌二醇(E2)、孕酮(P)等性激素水平，以及蓖麻油引起的未懷孕體質(zhì)健壯小鼠的卵巢、輸卵

8、管和子宮結(jié)構(gòu)變化進行研究，探討蓖麻油抗生育活性的作用機理。結(jié)果表明：20mg/kg/d劑量蓖麻油處理組小鼠動情期的時間和表現(xiàn)與對照組比較均無明顯區(qū)別；而40mg/kg/d及其以上處理組小鼠在動情期生理特征不明顯，動情期縮短，動情周期延長，主要是動情間期延長且不規(guī)則。小鼠血清中的雌二醇(E2)水平無明顯變化，而孕酮(P)含量有一定的升高；在20mg/kg/d處理組，小鼠血漿中的PAPP.A稍微低于對照組；而從40 mg/kg/d處理劑量開

9、始，PAPPA值降低顯著；且隨著蓖麻油處理濃度的增加，PAPP-A值降低程度增大；蓖麻油40mg/kg/d劑量處理組和以上濃度劑量處理組膨大子宮與正常對照未孕雌鼠子宮相比，其內(nèi)腔擴大，子宮壁明顯變??；肌肉層比對照組薄，肌纖維排列疏松、紊亂；子宮基質(zhì)層較薄，其內(nèi)腺體減少；黏膜上皮增厚。 3、通過用不同劑量蓖麻油處理原代培養(yǎng)大鼠蛻膜細胞和黃體細胞，觀察細胞形態(tài)變化，同時用MTT法檢測細胞活力，確定了蓖麻油抗雌鼠生育活性成分的作用靶標

10、，首次建立蓖麻油抗生育有效成分的體外篩選方法。結(jié)果表明：400μg/mL及其以上濃度蓖麻油處理液對體外培養(yǎng)大鼠蛻膜細胞形態(tài)有明顯的影響，400μg/mL蓖麻油處理液使部分離體培養(yǎng)蛻膜細胞體積比正常細胞明顯減小、細胞內(nèi)出現(xiàn)明顯空泡，部分細胞胞漿皺縮、死亡。MTT法檢測發(fā)現(xiàn)：400μg/mL及其以上處理濃度的蓖麻油對蛻膜細胞的生長有明顯的抑制作用(p<0.05)；蓖麻油對蛻膜細胞的半抑制濃度(IC<,50>)為568.6±5.3μg/mL，

11、r=+0.9790；且這一抑制作用具有良好的量-效關(guān)系。而蓖麻油對黃體細胞活力的抑制作用不顯著，僅僅表現(xiàn)在600μg/mL濃度蓖麻油處理24h的大鼠黃體細胞體積變小，細胞數(shù)量有些許減少。用大鼠離體培養(yǎng)蛻膜細胞的活力測定方法作為蓖麻油抗雌鼠生育有效成分分離、提純的活性跟蹤指標是可行的。 4、以原代培養(yǎng)大鼠蛻膜細胞(DSC)活力作為篩選靶標，首次導(dǎo)向分離蓖麻油(AEC)中的抗生育活性成分。經(jīng)過皂化、乙醚萃取、乙醇重結(jié)晶和活力檢測等步

12、驟，獲得一種對大鼠蛻膜細胞活力有抑制作用的無色晶體，其半抑制濃度(IC<,50>)為63.84±3.04μg/mL，r=+0.9478。GC-MS分析和計算機相似性比較表明：無色晶體由5種成分組成，其中有4成分為植物甾醇。 5、種成分分別是：麥角甾-5-稀-3-醇(Ergost-5-en-3-ol)，豆甾醇(Stigmasterol)，γ-谷甾醇(γ-Sitosterol)、巖藻甾醇(Fucosterol)，和普羅布考(Prob

13、ucol)類似物等。其中γ-谷甾醇(γ-Sitosterol)的含量最高，達44.77％；其余組分的含量分別是：豆甾醇(Stigmasterol)占35.80％，巖藻甾醇(Fucosterol)占8.40％，麥角甾-5-稀-3-醇(Ergost-5-en-3-ol)占6.10％和普羅布考(Probucol)類似物占4.93％。根據(jù)實驗結(jié)果和文獻報道推測：γ-谷甾醇(γ-Sitosterol)很有可能是抑制離體培養(yǎng)大鼠蛻膜細胞活力的主要成