水稻吸收和利用不同形態(tài)氮素的生理特征和相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控分析.pdf

1、水稻是中國乃至世界的主要糧食作物之一，而氮(N)是其生產(chǎn)的重要限制因子。水稻在淹水的條件下，以銨(NH<,4><'+>)作為主要的N源，但由于其根系的泌氧作用產(chǎn)生的根際硝化作用導(dǎo)致有相當(dāng)數(shù)量的N以硝態(tài)氮(NO<,3><'->-N)的形式吸收。前人已有報(bào)道，NH<,4><'+>和NO<,3><'->混合營養(yǎng)更有利于水稻的生長和N肥的利用。因此，深入認(rèn)識(shí)水稻吸收和利用NH<,4><'+>、NO<,3><'->的生理機(jī)制，特別是從分子水平鑒定

2、和分析調(diào)控NH<,4><'+>、NO<,3><'->吸收和利用相關(guān)基因的功能，將對(duì)水稻的生產(chǎn)和提高N肥利用率產(chǎn)生積極的作用。本論文以華東地區(qū)廣泛種植的粳稻品種“武運(yùn)粳7?！睘楣┰嚻贩N，研究了N饑餓7天(d)后，恢復(fù)供應(yīng)不同形態(tài)N源(NH<,4><'+>、NO<,3><'->、NH<,4><'+>NO<,3>)在0.5小時(shí)(h)到4 d對(duì)水稻N的吸收和積累及N還原同化中關(guān)鍵酶的生理差異和相關(guān)基因的調(diào)控，同時(shí)利用基因芯片對(duì)水稻恢復(fù)供應(yīng)不同形

3、態(tài)N素4 d后所調(diào)控表達(dá)的基因進(jìn)行了分析。另外，以粳稻模式種“日本晴(Nipponbare)”為材料，將基因啟動(dòng)子與GUS報(bào)告基因融合，研究了水稻高親和力NO<,3><'->轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的4個(gè)編碼基因(OsNRTT2；3、OsNRT2；4、OsNAR2；1和OsNAR2；2)的啟動(dòng)子的時(shí)空表達(dá)特異性，以進(jìn)一步推測(cè)它們的功能。主要研究結(jié)果如下： 1)通過水培試驗(yàn)，研究了N饑餓7 d后，恢復(fù)供應(yīng)不同形態(tài)N源對(duì)水稻(“武運(yùn)粳7?！?N的吸

4、收和積累及N同化中關(guān)鍵酶活性的影響。結(jié)果表明，缺N刺激根系的生長，增加了根冠比，供應(yīng)NH<,4><'+>營養(yǎng)抑制根系的生長，降低根冠比。與單一NO<,3><'->營養(yǎng)相比，供應(yīng)NH<,4><'+>營養(yǎng)顯著地增加地上部生物量和體內(nèi)的N積累。與單一NH<,4><'+>或NO<,3><'->營養(yǎng)相比，NH<,4>NO<,3>營養(yǎng)促進(jìn)了水稻對(duì)N的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)，葉片和根系中全N及葉片中NH<,4><'+>-N的含量以NH<,4>NO<,3>處理最高

5、，而且增強(qiáng)了根系的谷氨酰胺合成酶和葉片中硝酸還原酶的活性，提高了水稻同化和利用N的能力。另外，與單一NH<,4><'+>營養(yǎng)相比，供應(yīng)單一NO<,3><'->或NH<,4>NO<,3>混合營養(yǎng)顯著增加了根系活力，從而提高了根系吸收N的能力。 2)利用半定量RTPCR分析水稻根系的NH<,4><'+>、NO<,3><'->吸收和還原同化相關(guān)基因在恢復(fù)供應(yīng)不同形態(tài)N素的表達(dá)模式。水稻高親和力銨轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因AMT1家屬中OsAMT

6、1;1是組成型表達(dá)，基本上不受N供應(yīng)形態(tài)和狀態(tài)的影響：而在N饑餓脅迫下OsAMT1;2和OsAMT1;3的表達(dá)很弱，恢復(fù)供應(yīng)2.5 mM的NH<,4><'+>和1.25 mM NH<,4>NO<,3>分別增強(qiáng)了OsAMT1;2和OsAMT1;3的表達(dá)，NO<,3><'->營養(yǎng)對(duì)OsAMT1;2的表達(dá)有明顯的抑制作用；單一供NH<,4><'+>或短時(shí)間供NO<,3><'->(恢復(fù)供應(yīng)N 2h內(nèi))增強(qiáng)了OsAMT1;3表達(dá)。 說明O

7、sAMT1s基因不僅受NH<,4><'+>濃度的調(diào)控，而且也受NO<,3><'->或體內(nèi)外NH<,4><'+>和NO<,3><'->平衡的影響。水稻高親和的硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因OsNRT2;3，在N饑餓時(shí)有較高的表達(dá)，而在高N供應(yīng)時(shí)無論是單一NH<,4><'+>、單一NO<,3><'->還是NH<,4>NO<,3>營養(yǎng)均減弱其表達(dá)。在水稻N饑餓后供應(yīng)NO<,3><'->營養(yǎng)(NO<,3><'->或NH<,4>NO<,3>)迅速誘導(dǎo)了硝

8、酸還原酶編碼基因OsNiR1的表達(dá)，其中供NH<,4>NO<,3>比供單一NO<,3><'->更能促使OsNiR1的強(qiáng)烈而穩(wěn)定的表達(dá)。相反，在氮同化中起重要作用的谷氨酰胺合成酶(GS酶)編碼基因OsGS1;1的表達(dá)幾乎不受N供應(yīng)形態(tài)和缺N脅迫的影響。 3)利用包含水稻21，495寡核苷酸cDNA芯片(代表大約22，000個(gè)基因)，以NH<,4>NO<,3>營養(yǎng)的水稻根系和葉片樣品為對(duì)照，分析和鑒定了恢復(fù)供應(yīng)NH<,4><'+>-

9、N、NO<,3><'->-N和繼續(xù)缺N 4 d后所調(diào)控的水稻的基因。結(jié)果表明，不同N營養(yǎng)處理下，根系比葉片響應(yīng)更敏感。相比較NH<,4> NO<,3>營養(yǎng)，當(dāng)恢復(fù)供應(yīng)單一的NH<,4><'+>、NO<,3><'->，在根系顯著被調(diào)控達(dá)2倍以上的基因分別是445和324個(gè)，而地上部僅分別為32和58個(gè)。這些受調(diào)控的基因不僅包含了可能直接參與N的吸收和代謝途徑的基因，而且與葉綠素代謝及碳的固定和代謝密切相關(guān)。通過對(duì)這些被顯著調(diào)控的基因上游5

10、00bp的啟動(dòng)子區(qū)域中順式調(diào)控元件分析，鑒定到可能分別與NH<,4><'+>、NO<,3><'->特異誘導(dǎo)的上游調(diào)控基因相結(jié)合的順式調(diào)控元件分別是6個(gè)和8個(gè)。其中ARECOREZMGAPC4的順式調(diào)控元件是包含在幾乎所有的NO<,3><'->特異性誘導(dǎo)表達(dá)基因的啟動(dòng)子區(qū)，生物信息學(xué)分析表明它可能是MYB類型轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。另外，鑒定到受單一NH<,4><'+>、單一NO<,3><'->或N饑餓脅迫顯著(2倍以上)響應(yīng)的水稻18個(gè)轉(zhuǎn)錄

11、因子基因，其中在根系表達(dá)的有16個(gè)，而在地上部表達(dá)的僅有2個(gè)。 4)將編碼水稻高親和硝酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的啟動(dòng)子片段與GUS報(bào)告基因相融合，再轉(zhuǎn)入到水稻模式種“日本晴”的中，通過檢測(cè)GUS報(bào)告基因的表達(dá)，分析了OsNRT2;3、OsNRT2；4、OsNAR2；1和OsNAR2；2的時(shí)空表達(dá)特異性和它們可能的生理功能。OsNRT2；3在根的中柱和葉脈表達(dá)，其功能可能不是主要承擔(dān)對(duì)外部介質(zhì)中NO<,3><'->的吸收，而是負(fù)責(zé)在體內(nèi)對(duì)