產(chǎn)甲烷短桿菌M1膜蛋白EhaF異源表達(dá)及其對山羊甲烷排放影響的研究.pdf

1、降低反芻動物甲烷的排放，不僅能提高其對飼料的利用率，還可以減輕溫室效應(yīng)，緩解氣候變暖，具有重要的生產(chǎn)實(shí)踐意義和環(huán)境保護(hù)意義，但目前還缺乏行之有效的技術(shù)手段。本試驗(yàn)將產(chǎn)甲烷短桿菌M1中編碼膜蛋白EhaF的基因在大腸桿菌中表達(dá)，并研究表達(dá)產(chǎn)物免疫山羊后對山羊甲烷排放量和瘤胃古菌結(jié)構(gòu)和組成的影響。
　　先從產(chǎn)甲烷短桿菌Methanobrevibacter ruminantium M1全基因序列的適合于克隆和異源表達(dá)抗原蛋白的基因中，挑選

2、出候選的抗原基因mru1407。以山羊瘤胃微生物DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增到候選基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET30a(+)-mru1407，并將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosseta中進(jìn)行表達(dá)，利用Ni-NTA分離純化出表達(dá)的重組蛋白EhaF，用質(zhì)譜分析檢測純化蛋白EhaF的氨基酸序列。挑選12只健康山羊作為試驗(yàn)動物，按照體重相近原則將其分為對照組與免疫組，每組設(shè)6個重復(fù)，每個重復(fù)1頭羊。所有試驗(yàn)動物統(tǒng)一飼喂精粗比為3∶7的全混合日糧，經(jīng)14天預(yù)飼期

3、后開始正式試驗(yàn)。正式試驗(yàn)的第0天對照組注射1ml佐劑與1ml洗脫液組成的混合液，免疫組注射含400μg重組蛋白EhaF的1ml洗脫液與1ml佐劑組成的混合液。在第35，49天分別加強(qiáng)免疫1次，并在第56天采集血液及唾液，抽取瘤胃液，冷凍保存?zhèn)溆?。?3天，采用開放式呼吸測熱室檢測山羊甲烷排放量的變化。用ELISA法測定血清、唾液和瘤胃液抗體滴度指標(biāo)，用自動生化分析儀檢測血液紅細(xì)胞等常規(guī)指標(biāo)及谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮等生化指標(biāo)。用D

4、NA試劑盒在保存的瘤胃液中提取總DNA，利用古菌V4區(qū)引物PCR擴(kuò)增瘤胃古菌V4區(qū)16s rDNA，利用Miseq測序的Illumina平臺對擴(kuò)增到的DNA進(jìn)行高通量測序，得到的數(shù)據(jù)用Qiime軟件分析，檢測瘤胃菌古菌物種多樣性及豐度，產(chǎn)甲烷菌含量的變化。
　　結(jié)果表明:(1)產(chǎn)甲烷短桿菌M1膜蛋白EhaF能夠在大腸桿菌內(nèi)得到表達(dá)，并可用Ni-NTA對其純化，表達(dá)的蛋白EhaF氨基酸序列與理論氨基酸序列完全一致。(2)對山羊注射蛋

5、白EhaF能夠引起山羊的免疫應(yīng)答，免疫后的山羊唾液、血清及瘤胃液抗體滴度極顯著升高(P＜0.01)。(3)注射重組蛋白EhaF對山羊血液常規(guī)指標(biāo)血液生化指標(biāo)無顯著影響(P＞0.05)。(4)注射重組蛋白EhaF不能夠顯著降低山羊每公斤干物質(zhì)甲烷排放量(P＞0.05)。(5)山羊瘤胃古菌主要由Euryarchaeota門的Methanobacteriaceae、Methanomicrobiaceae、Methanosaetaceae、 M

6、ethanosarcinaceae、Marine_GroupⅡ、vadinCA11_ gut_group共6個科組成，其中豐度最高的分別為Methanobacteriaceae科(58.43％)，vadinCA11_gut_group科(37.8％)，在屬水平上豐度最高的古菌為Methanobrevibacter屬(57.40％)。(6)免疫重組蛋白EhaF對山羊瘤胃古菌的物種多樣性及豐度無顯著影響(P＞0.05)。(7)在屬水平上，免

7、疫重組蛋白EhaF對山羊瘤胃產(chǎn)甲烷菌屬M(fèi)ethanobacterium、Methanobrevibacter、Methanomicrobium、Methanosaeta、Methanimicrococcus的含量無顯著影響(P＞0.05)。
　　綜上所述，產(chǎn)甲烷菌Methanobrevibacter ruminantium M1的膜蛋白EhaF能夠在大腸桿菌中正確表達(dá)，對山羊免疫重組蛋白EhaF可引起其免疫應(yīng)答，但對山羊血液常規(guī)指