轉(zhuǎn)玉米C4型NADP-ME基因小麥的分子特征和光合生理特性研究.pdf

1、將C4植物C4光合循環(huán)的關(guān)鍵基因?qū)隒3植物以改良后者的光合效能已成為C3植物水稻、小麥等遺傳改良工作的熱點(diǎn)，詳細(xì)研究C4植物C4光合循環(huán)的關(guān)鍵基因在轉(zhuǎn)基因C3農(nóng)作物中的分子特征與光合生理效能對(duì)開(kāi)展C3農(nóng)作物高光效育種具有十分積極的科學(xué)意義。本文對(duì)轉(zhuǎn)玉米C4型NADP-ME(NADP-蘋(píng)果酸酶)基因小麥進(jìn)行分子特征和光合生理特性鑒定，探討C4型NADP-ME對(duì)小麥光合效能的影響作用，探索小麥產(chǎn)量潛力改良的新途徑。
　　1.轉(zhuǎn)玉米C

2、4型NADP-ME基因小麥的分子特征鑒定
　　對(duì)T3代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行系統(tǒng)的分子特征鑒定分析。轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照基因組DNA進(jìn)行PCR檢測(cè)和Southern雜交，表明轉(zhuǎn)NADP-ME基因株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4均以2個(gè)拷貝整合到了轉(zhuǎn)基因株系小麥基因組的不同位點(diǎn);轉(zhuǎn)基因株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4蛋白水平的表達(dá)分別較受體對(duì)照提高了1.90-2.77和2.50-2.95倍。這表明外源NADP

3、-ME基因已在轉(zhuǎn)基因小麥后代中獲得了正確的轉(zhuǎn)錄和翻譯，轉(zhuǎn)基因株系的表達(dá)水平均顯著高于受體對(duì)照。
　　2.轉(zhuǎn)玉米C4型NADP-ME基因小麥的轉(zhuǎn)錄表達(dá)特性
　　對(duì)轉(zhuǎn)基因株系和對(duì)照進(jìn)行qRT-PCR和酶活性檢測(cè)分析，轉(zhuǎn)基因株系在不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期其N(xiāo)ADP-ME基因轉(zhuǎn)錄水平規(guī)律為:開(kāi)花期＞抽穗期＞拔節(jié)期＞花后7天＞花后15天。對(duì)T3代轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行光合生理生化分析。轉(zhuǎn)基因株系不同時(shí)期不同器官中酶活性均高于受體對(duì)照，其中不同部位酶活

4、性變化規(guī)律為葉＞鞘＞莖＞穗，相同部位酶活性變化規(guī)律為開(kāi)花期＞抽穗期＞拔節(jié)期＞花后7天開(kāi)花期＞花后15天。其中，轉(zhuǎn)基因株系10T(9)-1-1酶活的表達(dá)水平在拔節(jié)期、抽穗期和花后7天較受體對(duì)照分別提高了1.69、1.46和2.33倍，差異均達(dá)顯著水平;轉(zhuǎn)基因株系10T(9)-225-4酶活的表達(dá)水平在開(kāi)花期、花后7天和花后15天較對(duì)照分別提高了1.58、2.12和1.75倍，差異均達(dá)顯著水平，拔節(jié)期較受體對(duì)照提高了2.52倍，差異達(dá)極顯著

5、水平。
　　3.轉(zhuǎn)玉米C4型NADP-ME基因小麥的光合特性及農(nóng)藝性狀
　　轉(zhuǎn)基因株系不同時(shí)期凈光合速率均低于對(duì)照，不同時(shí)期凈光合速率變化規(guī)律為抽穗期＞開(kāi)花期＞花后7天＞花后15天＞拔節(jié)期，10T(9)-1-1在抽穗期、花后7天、花后15天與受體對(duì)照的差異均達(dá)顯著，分別較受體對(duì)照降低了14.95％、17.26％、7.34％;10T(9)-225-4在拔節(jié)期、抽穗期、開(kāi)花期與受體對(duì)照的差異也達(dá)到顯著，分別較受體對(duì)照降低了13.

6、00％、8.06％、9.26％。轉(zhuǎn)基因小麥株系和對(duì)照凈光合速率日變化顯示:4個(gè)測(cè)定日的Pn（凈光合速率）日變化趨勢(shì)相同，均呈現(xiàn)雙峰曲線(xiàn)，但轉(zhuǎn)基因小麥旗葉Pn在4個(gè)測(cè)定日6:00-18:00期間均低于對(duì)照。轉(zhuǎn)基因小麥的Ci（胞間CO2濃度）明顯高于對(duì)照，而Gs（氣孔導(dǎo)度）和Tr（蒸騰速率）明顯低于對(duì)照。
　　對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥株系和對(duì)照進(jìn)行凈光合速率響應(yīng)曲線(xiàn)分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小麥的飽和光強(qiáng)約為1400.33μmol·m-2·s-1，對(duì)照

7、的飽和光強(qiáng)約為:1599.33μmol·m-2·s-1，轉(zhuǎn)基因小麥比對(duì)照光飽和點(diǎn)下降12.44％;溫度在20℃-25℃之間轉(zhuǎn)基因NADP-ME小麥和對(duì)照凈光合速率差異不明顯，在低于20℃或高于25℃時(shí)轉(zhuǎn)基因NADP-ME較受體對(duì)照下降明顯，但二者的最適溫度均為30℃;轉(zhuǎn)基因小麥和對(duì)照羧化效率分別為:0.0585和0.0838，較對(duì)照降低了30.19％。這表明轉(zhuǎn)玉米C4型NADP-ME小麥同化CO2的能力下降。
　　對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥株系

8、和對(duì)照進(jìn)行產(chǎn)量性狀分析。轉(zhuǎn)基因株系10T(9)-1-1和10T(9)-225-4在生物學(xué)產(chǎn)量、單株產(chǎn)量和千粒重與受體對(duì)照相比分別降低了3.10％、0.58％、4.06％和1.60％、3.84％、3.92％，其中轉(zhuǎn)基因小麥千粒重與對(duì)照差異達(dá)到顯著水平，株高、分蘗數(shù)和單株穗數(shù)則無(wú)明顯變化。
　　4.轉(zhuǎn)玉米C4型NADP-ME基因小麥的光合速率下降機(jī)制
　　對(duì)轉(zhuǎn)基因小麥株系和對(duì)照旗葉蘋(píng)果酸含量和丙酮酸含量測(cè)定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因株系1

9、0T(9)-1-1和10T(9)-225-4旗葉蘋(píng)果酸含量較對(duì)照分別降低了2.2％和8.8％，丙酮酸含量較對(duì)照分別提高了8.3％和25％;噴施蘋(píng)果酸之后，轉(zhuǎn)基因小麥及其對(duì)照凈光合速率分別增長(zhǎng)了5.80％和1.16％轉(zhuǎn)基因和對(duì)照凈光合速率沒(méi)有明顯差異。轉(zhuǎn)基因小麥氣孔張開(kāi)率較對(duì)照相比降低了15.12％。氣孔導(dǎo)度為:253.30mmol·m-2·s-1，對(duì)照為288.50mmol·m-2·s-1較對(duì)照下降了12.20％。說(shuō)明旗葉中蘋(píng)果酸的含量

10、調(diào)控著旗葉氣孔張開(kāi)率和氣孔導(dǎo)度，轉(zhuǎn)基因小麥氣孔張開(kāi)率和氣孔導(dǎo)度的下降是由于蘋(píng)果酸含量下降導(dǎo)致的，進(jìn)而導(dǎo)致凈光合速率的下降。
　　5.轉(zhuǎn)玉米C4型PEPC+NADP-ME基因小麥的凈光合速率測(cè)定結(jié)果
　　轉(zhuǎn)NADP-ME基因小麥凈光合速率為25.53μmol·m-2·s-1，較受體對(duì)照降低了2.98％;轉(zhuǎn)PEPC基因小麥凈光合速率為26.93μmol·m-2·s-1，較受體對(duì)照提高了5.43％差異達(dá)到顯著水平;轉(zhuǎn)PEPC+NA