牙周炎相關(guān)表觀遺傳學(xué)酶的篩選及分析.pdf

1、健康的牙周組織是正常牙齒發(fā)揮功能的保障，而牙周炎的發(fā)生往往導(dǎo)致牙周組織的漸進(jìn)性破壞，如未得到及時(shí)治療，最終造成牙齒松動(dòng)脫落，現(xiàn)已成為我國(guó)成年人牙齒缺失的首要原因。不僅如此，已有研究證實(shí)牙周炎與全身多系統(tǒng)的發(fā)病率具有相關(guān)性如心腦血管疾病、低體重早產(chǎn)兒、糖尿病等。因此牙周炎的防治逐漸成為人們關(guān)注的話題。眾所周知，牙周炎是一種以菌斑為始動(dòng)因素的多因素疾病，目前臨床上治療牙周炎的方法主要以控制菌斑為主，主要包括潔治術(shù)、刮治術(shù)、翻瓣術(shù)等，能夠有效

2、延緩/控制牙周炎的發(fā)生，但臨床上有時(shí)會(huì)發(fā)現(xiàn)這樣的現(xiàn)象：口腔衛(wèi)生較差的患者，其牙周炎的病變程度較輕，而口腔衛(wèi)生較好的患者可能伴有嚴(yán)重的牙周病損。同樣臨床表征的患者采用同種治療方法后，患者的疾病預(yù)后也不盡相同。為了解釋這些現(xiàn)象，有研究發(fā)現(xiàn)飲食、吸煙、口腔環(huán)境、細(xì)菌等因素可以通過(guò)影響宿主參與炎癥反應(yīng)的基因，從而影響口腔健康。而近年來(lái)發(fā)現(xiàn)這些因素皆與表觀遺傳具有相關(guān)性。
　　表觀遺傳是與遺傳相對(duì)提出的，是指DNA序列不發(fā)生變化，而基因表達(dá)

3、發(fā)生了可遺傳性變化，此種變化是細(xì)胞內(nèi)除了遺傳信息以外的其他可遺傳物質(zhì)的改變，且在發(fā)育和細(xì)胞增殖過(guò)程中能穩(wěn)定傳遞。表觀遺傳主要包括DNA甲基化、組蛋白修飾及染色體重塑等多種形式，其中DNA甲基化和組蛋白修飾是表觀遺傳的兩種主要方式。表觀遺傳修飾滲透了人類健康與疾病的全部領(lǐng)域。表觀遺傳修飾，在功能上，是基因組適應(yīng)環(huán)境變化的一種有效手段；在機(jī)制上，是通過(guò)各種不影響DNA序列的方法對(duì)基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)控；由于生物總是要對(duì)環(huán)境的各種變化進(jìn)行適應(yīng)，而同

4、時(shí)要竭力維持遺傳序列的穩(wěn)定性，這就使得表觀遺傳修飾幾乎每時(shí)每刻都在發(fā)生著變化，表觀遺傳的發(fā)生主要由表觀遺傳學(xué)酶來(lái)調(diào)控?，F(xiàn)有研究表明，表觀遺傳與腫瘤、心血管疾病、神經(jīng)退行性變及類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。那么，在牙周炎的發(fā)生過(guò)程中表觀遺傳是否參與其中，有哪些表觀遺傳學(xué)酶發(fā)生了變化，哪些表觀遺傳學(xué)酶可能為關(guān)鍵酶，這些酶又是如何影響細(xì)胞的生物學(xué)性能從而影響牙周健康的，有待進(jìn)一步的探索，這對(duì)于牙周病的診治和識(shí)別患者的患病風(fēng)險(xiǎn)具有潛在

5、意義。
　　目的:
　　通過(guò)分離培養(yǎng)同一患者來(lái)源的炎癥牙周膜干細(xì)胞（inflamed periodontal ligament stem cells，i-PDLSCs）和正常牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）,以PDLSCs為對(duì)照，篩選i-PDLSCs中變化明顯的表觀遺傳學(xué)酶，并驗(yàn)證目標(biāo)酶對(duì)牙周膜干細(xì)胞增殖能力的影響，為表觀遺傳與牙周炎的相關(guān)性提供理論依據(jù)。
　

6、　方法:
　　1.炎性牙周膜干細(xì)胞（i-PDLSCs）和正常牙周膜干細(xì)胞（PDLSCs）的分離、純化培養(yǎng)和鑒定
　　我們選取同一患者因牙周炎而拔除的無(wú)功能牙和因阻生而拔除的新鮮健康第三磨牙，采用酶消化與組織塊聯(lián)合法分別分離培養(yǎng)原代正常和炎癥牙周膜細(xì)胞；采用有限稀釋法純化i-PDLSCs和PDLSCs；使用流式細(xì)胞儀對(duì)分離純化出的兩種細(xì)胞的干細(xì)胞相關(guān)表面標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)及鑒定；采用MTT及克隆形成方法檢測(cè)兩種細(xì)胞增殖能力；采用成

7、骨、成脂誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)對(duì)兩種細(xì)胞的多向分化潛能進(jìn)行檢測(cè)。
　　2.牙周炎相關(guān)表觀遺傳學(xué)酶的篩選
　　通過(guò)文獻(xiàn)查閱獲得已有相關(guān)報(bào)道的表觀遺傳各家族酶共72個(gè)（附表1）。通過(guò)將同一患者來(lái)源的i-PDLSCs和PDLSCs對(duì)比，篩選牙周炎過(guò)程中變化明顯的表觀遺傳學(xué)酶，首先分別收集兩種細(xì)胞，提取兩種細(xì)胞總RNA，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR進(jìn)行篩選，以PDLSCs為對(duì)照組，確定i-PDLSCs中變化較為明顯的表觀遺傳學(xué)酶。為進(jìn)一步驗(yàn)證所篩選的結(jié)果，

8、利用TNF-α對(duì)PDLSCs進(jìn)行炎性刺激以模擬炎性環(huán)境，收集正常組與炎性誘導(dǎo)組細(xì)胞，提取總RNA后通過(guò)RT-PCR篩選兩組中變化較為明顯的表觀遺傳學(xué)酶。根據(jù)體內(nèi)炎性環(huán)境直接來(lái)源的i-PDLSCs及體外炎性刺激來(lái)源的i-PDLSCs所篩選的兩組結(jié)果，確定牙周炎相關(guān)表觀遺傳學(xué)酶。
　　3. KAT2A對(duì)牙周膜干細(xì)胞增殖能力的影響
　　根據(jù)實(shí)驗(yàn)二的篩選結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們選定KAT2A為本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)表觀遺傳學(xué)酶，并對(duì)其進(jìn)行功能

9、驗(yàn)證。為探尋表觀遺傳學(xué)酶對(duì)牙周膜干細(xì)胞的影響，我們首先通過(guò)蛋白免疫印跡法（WB）驗(yàn)證所篩選出的目標(biāo)酶 KAT2A在i-PDLSCs和PDLSCs中的表達(dá)情況；然后利用KAT2A si-RNA對(duì)PDLSCs進(jìn)行目標(biāo)酶表達(dá)沉默，通過(guò)RT-PCR及 WB進(jìn)行沉默效能檢測(cè)；成功沉默后，對(duì)沉默前后兩組細(xì)胞的增殖能力采用MTT法、克隆形成、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期法以及RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞周期相關(guān)基因CCD1、CCE1及E2F1的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。<

10、br>　　4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　所有數(shù)據(jù)使分別用SPSS19.0和GraphPad Prism5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和作圖分析處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±SD）形式表示，兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.本實(shí)驗(yàn)共取材12例，其中i-PDLSCs培養(yǎng)成功8例，PDLSCs培養(yǎng)成功10例，共同培養(yǎng)成功7例。3-7d顯微鏡下可以觀察到貼壁細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)呈梭形，集落樣生長(zhǎng)。有限稀釋法挑選單細(xì)胞克隆

11、，擴(kuò)大培養(yǎng)后獲得兩種高純度干細(xì)胞。流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示兩種細(xì)胞均陽(yáng)性表達(dá)CD146、CD105，陰性表達(dá)造血干細(xì)胞標(biāo)記CD45和內(nèi)皮干細(xì)胞表面標(biāo)記 CD31。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞均具有較強(qiáng)的增殖能力，但i-PDLSCs的增殖能力明顯。茜素紅染色后兩種細(xì)胞均可以觀察到礦化結(jié)節(jié)，油紅O染色后鏡下均可以觀察到脂滴。證明我們所分離、純化培養(yǎng)的兩種細(xì)胞為高純度的人牙周膜干細(xì)胞。
　　2.分別提取同一患者來(lái)源i-PDLSCs和PDLSCs兩

12、種細(xì)胞總RNA，通過(guò)RT-PCR觀察兩種細(xì)胞中表觀遺傳學(xué)酶表達(dá)情況，結(jié)果顯示表觀遺傳學(xué)酶在i-PDLSCs和PDLSCs兩組中表達(dá)并不一致，這與我們預(yù)期的情況是相符的。根據(jù)原始篩選結(jié)果中組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶家族的變化情況以及以往研究，我們確定組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶為重點(diǎn)篩查家族。RT-PCR篩查結(jié)果顯示多數(shù)組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶在i-PDLSCs組中表達(dá)較PDLSCs低。分析總結(jié)各組樣本RT-PCR篩查結(jié)果發(fā)現(xiàn)：多數(shù)組蛋白乙酰化轉(zhuǎn)移酶（KAT2A

13、、ELP3、HAT1、KAT6A和KAT6B）在i-PDLSCs組中表達(dá)較PDLSCs組低，少數(shù)組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶（NCOA3和GTF3C4）在i-PDLSCs中表達(dá)較PDLSCs組高。
　　進(jìn)一步利用TNF-α炎性因子體外模擬炎性環(huán)境對(duì)PDLSCs進(jìn)行炎性刺激，收集正常組與炎性刺激組細(xì)胞，提取總RNA，通過(guò)RT-PCR篩選兩組中變化較為明顯的表觀遺傳學(xué)酶。篩選結(jié)果與上述結(jié)果基本一致，即多數(shù)組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶在炎性環(huán)境下表達(dá)呈下降

14、趨勢(shì)。分析總結(jié)以上結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，KAT2A、KAT6A和KAT6B的表達(dá)在炎癥組及炎性刺激組中表達(dá)降低。
　　3.根據(jù)實(shí)驗(yàn)二的篩選結(jié)果及相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，我們選定 KAT2A為本實(shí)驗(yàn)的目標(biāo)表觀遺傳學(xué)酶，并對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證。使用 si-RNA沉默 PDLSCs中 KAT2A的表達(dá)，RT-PCR及WB檢測(cè)顯示，沉默效率達(dá)到50％，說(shuō)明我們?cè)赑DLSCs中成功沉默了KAT2A。KAT2A沉默后，其克隆集落形成能力、增殖能力均較沉默

15、前明顯下降（P<0.05）。流式細(xì)胞周期檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，沉默 KAT2A后，S期細(xì)胞明顯下降，多數(shù)阻滯于G1期。另外，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，，KAT2A沉默后細(xì)胞周期素CCD1、CCE1及E2F1表達(dá)量較沉默前也均有所降低。
　　結(jié)論:
　　1.正常來(lái)源與炎性來(lái)源牙周膜干細(xì)胞均可成功分離，純化培養(yǎng)后，經(jīng)流式檢測(cè)、MTT檢測(cè)、克隆形成實(shí)驗(yàn)、成脂及成骨誘導(dǎo)分化確定，兩者均符合間充質(zhì)干細(xì)胞特性。
　　2.炎性微環(huán)境影響了PDLSC