溫度馴化對(duì)斑馬魚發(fā)育影響的表觀遺傳學(xué)研究.pdf

1、環(huán)境溫度對(duì)生物的影響貫穿其整個(gè)生活史，包括生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖、運(yùn)動(dòng)等多個(gè)重要的生物學(xué)過程。有氣象預(yù)測(cè)顯示由于全球變暖引起的極端高溫和由于北極冰蓋融化引起的寒潮將會(huì)頻繁侵襲我國(guó)。
　　魚類生活在水環(huán)境中，水溫的變化對(duì)魚類的行為和生理生化活動(dòng)影響巨大。極端溫度會(huì)使水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)遭受重大的損失，使養(yǎng)殖魚類品質(zhì)下降或?qū)е麓竺娣e死亡。因此，研究溫度對(duì)魚類的影響就顯得至關(guān)重要。斑馬魚是一種重要的水生生物模型，具有拼接完整的基因組和可信度較高的基因注

2、釋結(jié)果，可以滿足轉(zhuǎn)錄組、甲基化組等高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析的需要。近年來的研究結(jié)果對(duì)斑馬魚在低溫下的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)有比較透徹的概述，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了斑馬魚與羅非魚耐寒能力差異的分子機(jī)制。為我們選擇以斑馬魚作為研究對(duì)象奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
　　近年來多項(xiàng)研究表明，生物體在弱于極端溫度的條件下，將會(huì)產(chǎn)生溫度馴化效應(yīng)，使其耐受極端溫度的能力上升。另外有一些研究表明環(huán)境因素對(duì)生物體產(chǎn)生的影響可以持續(xù)很長(zhǎng)的時(shí)間，甚至?xí)绊懫浜蟠纳婺芰ΑＨ欢@些研究工作主要

3、集中在植物領(lǐng)域，對(duì)動(dòng)物尤其是魚類的研究還比較少。因此，研究模式魚類——斑馬魚對(duì)溫度馴化的響應(yīng)機(jī)制就顯得至關(guān)重要。為了從多角度探究斑馬魚對(duì)溫度馴化的響應(yīng)機(jī)制分別設(shè)計(jì)了三個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。
　　首先，將斑馬魚ZF4細(xì)胞（正常培養(yǎng)溫度28℃）進(jìn)行短期低溫馴化（18℃/5d）和長(zhǎng)期低溫馴化（18℃/30d），探究在沒有神經(jīng)調(diào)節(jié)和激素調(diào)節(jié)的情況下，魚類細(xì)胞本身是否能夠獲得溫度馴化效應(yīng)。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，將常溫（28℃）、短期馴化（18℃/5d）、長(zhǎng)期

4、馴化（18℃/30d）的ZF4細(xì)胞放入細(xì)胞致死低溫（10℃/3d）后，通過細(xì)胞存活率檢測(cè)和alamar blue還原性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，不管短期馴化和長(zhǎng)期馴化的ZF4細(xì)胞的耐低溫能力都增強(qiáng)，說明其都獲得了溫度馴化效應(yīng)。利用 MeDIP-seq的方法研究常溫（28℃）、短期馴化（18℃/5d）、長(zhǎng)期馴化（18℃/30d）的ZF4細(xì)胞的甲基化的狀態(tài)。研究發(fā)現(xiàn)寒冷壓力可以改變 ZF4細(xì)胞 DNA甲基化模式，短期低溫馴化后DNA甲基化的水平增加，而

5、在長(zhǎng)期低溫馴化后DNA甲基化的水平有所恢復(fù)，且稍稍低于對(duì)照組。通過分析找到了1024個(gè)低溫馴化后啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生明顯改變的基因，并對(duì)這些基因做了GO富集和KEGG富集分析，結(jié)果顯示短期低溫馴化后參與葉酸合成通路的相關(guān)基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生了顯著的欠甲基化，由于葉酸可以作為5mC的甲基供體，因此推測(cè)葉酸合成通路的激活可能與短期馴化后整體甲基化水平升高有關(guān)。利用MeDIP-qPCR和BSP驗(yàn)證生物信息分析得到的差異甲基化區(qū)域（DMRs），結(jié)果顯

6、示MeDIP-qPCR和BSP的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與MeDIP-seq的測(cè)序結(jié)果基本相符。
　　結(jié)果顯示，在沒有神經(jīng)調(diào)節(jié)和激素調(diào)節(jié)的條件下，斑馬魚細(xì)胞本身就可以對(duì)溫度馴化產(chǎn)生反應(yīng)。
　　其次，為了研究溫度馴化是否能夠?qū)Π唏R魚產(chǎn)生持續(xù)的影響，并進(jìn)一步探究產(chǎn)生持續(xù)性影響的分子機(jī)制。將斑馬魚受精卵分別放入不同胚胎發(fā)育溫度（22℃，27℃，32℃）中發(fā)育出膜，簡(jiǎn)稱TE22、TE27、TE32，然后于常溫（27℃）下飼養(yǎng)8個(gè)月，以BS-seq的

7、方法檢測(cè)各組斑馬魚成魚肌肉中 DNA甲基化水平。通過分析 gene、peseudogene、lincRNA、CGI、miRNA、rRNA及其上下游2Kb區(qū)域的甲基化狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，在gene body區(qū)域可以觀察到TE32的甲基化水平稍微高于TE22和 TE27，而在上游和下游2K的區(qū)域，TE32的甲基化水平稍微低于TE22和TE27，在CpG島區(qū)域，TE27的甲基化水平略高于TE22，而TE32的甲基化水平最低。在miRNA和rRNA區(qū)域并

8、沒有看到甲基化水平明顯降低的區(qū)域，但是其本身的甲基化水平變化比較劇烈。methylKit分析發(fā)現(xiàn)，TE22和TE27、TE32和TE27之間存在大量DMCs位點(diǎn)，并且差異甲基化位點(diǎn)在每個(gè)染色體上比例大致相同。DMRs分析發(fā)現(xiàn)TE22 vs TE27之間的差異甲基化區(qū)域（DMRs）為1915個(gè)，其中超甲基化區(qū)域?yàn)?90個(gè)，欠甲基化區(qū)域?yàn)?25個(gè)。TE32 vs TE27之間的差異甲基化區(qū)域（DMRs）為2646個(gè)，其中超甲基化區(qū)域?yàn)?50

9、6個(gè)，欠甲基化區(qū)域?yàn)?140個(gè)。
　　結(jié)果顯示，斑馬魚不同胚胎發(fā)育溫度（22℃，27℃，32℃）可以導(dǎo)致斑馬魚成魚的肌肉中特定區(qū)域的甲基化水平發(fā)生變化，證明溫度馴化可以對(duì)斑馬魚肌肉的DNA甲基化狀態(tài)產(chǎn)生持續(xù)性的影響。
　　最后，為研究斑馬魚中低溫馴化效應(yīng)是否能夠遺傳，將在常溫（27℃）下飼養(yǎng)6個(gè)月的32對(duì)斑馬魚分成兩組，每組16對(duì)，一組繼續(xù)在常溫（27℃±0.5℃）下飼養(yǎng)，編號(hào) TA27，另一組放置于低溫（22℃±0.5℃）

10、下飼養(yǎng)，編號(hào)TA22，馴化時(shí)長(zhǎng)為4個(gè)月。分別配對(duì)TA27和 TA22兩組斑馬魚，在產(chǎn)卵后的30min內(nèi)收集受精卵，放入培養(yǎng)皿中，將TA27組和TA22組的受精卵分為兩份，分別放置于27℃與20℃，統(tǒng)計(jì)四個(gè)培養(yǎng)皿中受精卵的出膜率，評(píng)估斑馬魚受精卵的低溫耐受能力。分別取TA27、TA22斑馬魚卵巢和在低溫20℃處理0h、2h、4h、6h、8h的受精卵，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，進(jìn)而進(jìn)行差異表達(dá)基因、GO和KEGG分析，并對(duì)表觀酶類的表達(dá)水平進(jìn)行分析。

11、結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過22℃馴化的斑馬魚的后代在致死溫度下（20℃）可以正常發(fā)育，并順利完成卵裂期，進(jìn)入下一發(fā)育時(shí)期。而未馴化的斑馬魚在低溫下，會(huì)導(dǎo)致卵裂異常的表型，例如卵裂時(shí)細(xì)胞間隙過大、出現(xiàn)兩個(gè)分裂球，更有甚者會(huì)出現(xiàn)卵破碎的現(xiàn)象。將非馴化組斑馬魚所產(chǎn)的卵置于常溫下發(fā)育一定時(shí)間，再放置于低溫下，可以發(fā)現(xiàn)在常溫發(fā)育3h以內(nèi)的受精卵不能完成胚胎發(fā)育，而在常溫發(fā)育3.5h以后的受精卵則可以順利完成胚胎發(fā)育，進(jìn)而出膜。這證明胚胎發(fā)育的前三個(gè)小時(shí)是易受到

12、溫度影響的敏感期，而對(duì)親代的低溫馴化可以使其所產(chǎn)的受精卵度過這段時(shí)期，正常完成卵裂。GO富集分析顯示大量與信號(hào)通路激活、細(xì)胞間黏連的相關(guān)的生物學(xué)過程被激活。涉及大量與離子相關(guān)的生物學(xué)過程，例如離子通道活性、鈣離子結(jié)合、鈣離子通道復(fù)合體。涉及較多信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)的生物學(xué)過程，例如G蛋白偶聯(lián)受體活性、G蛋白受體信號(hào)通路、細(xì)胞間的信號(hào)傳導(dǎo)、信號(hào)傳導(dǎo)活性、Rho蛋白的信號(hào)傳導(dǎo)。涉及細(xì)胞移動(dòng)和固著等過程，例如細(xì)胞固著、細(xì)胞移動(dòng)、細(xì)胞生長(zhǎng)等過程。與生長(zhǎng)

13、繁殖有關(guān)的過程，例如，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體結(jié)合、干細(xì)胞分化、發(fā)育的負(fù)調(diào)節(jié)作用、胚胎器官發(fā)育等過程。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)鈣離子信號(hào)通路富集程度較高。GPCR信號(hào)通路可以調(diào)控 Ca2+信號(hào)通路的激活。由此可以進(jìn)一步推測(cè) GPCR信號(hào)通路首先感知溫度降低，然后通過IP3影響Ca2+信號(hào)通路，使Ca2+信號(hào)通路激活。因此，斑馬魚低溫馴化下產(chǎn)生的耐寒能力可能就是通過激活 Ca2+信號(hào)通路而產(chǎn)生的。通過對(duì)多種組蛋白修飾相關(guān)酶