大鼠雌性生殖干細胞建系、生物學特性研究與應用.pdf

1、生殖發(fā)育是人類基本生命活動之一。長期以來,人們普遍接受出生后雌性哺乳動物的生殖細胞不具備增殖活性的觀點;直到近年,相繼揭示在成年小鼠與人卵巢中存在雌性生殖干細胞,才開始一個全新領域的研究。
　　在繼小鼠、人的卵巢中分離出雌性生殖干細胞之后,我們嘗試著對大鼠進行相應的研究;本研究不僅為雌性生殖干細胞在哺乳動物中普遍存在提供證據(jù),同時,也為干細胞家族帶來新成員,為構建大鼠轉(zhuǎn)基因模型提供新的技術路線。
　　本文首先對大鼠卵巢中Fr

2、agilis與DDX4的表達定位進行了比較,發(fā)現(xiàn)在卵巢皮質(zhì)處的相同類型細胞中這兩種蛋白均有表達;通過Fragilis/BrdU與DDX4/BrdU兩種雙熒光免疫標記結合組織學定位,在5天齡與4-5周齡大鼠卵巢皮質(zhì)處均檢測到雙熒光信號即具有增殖活性的生殖細胞。對5天齡卵巢酶解后,使用Fragilis抗體對細胞懸液進行免疫磁珠分選,純化后進行體外培養(yǎng),成功建立SD大鼠雌性生殖干細胞系。
　　經(jīng)過對多種標記基因、堿性磷酸酶、端粒酶、核型

3、與甲基化狀態(tài)等多種特征不同水平的鑒定,證實了該細胞系的生殖特性與干細胞特性,并在體內(nèi)與體外對該細胞系的功能進行了檢測。將該細胞系移植至不孕大鼠卵巢中,能恢復其生殖能力;通過這種方式成功建立了GFP轉(zhuǎn)基因大鼠和fat-1轉(zhuǎn)基因大鼠,為構建基因修飾大鼠模型提供了新方法。
　　另外,我們對fat-1轉(zhuǎn)基因大鼠的研究發(fā)現(xiàn),與fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠一樣,與野生型大鼠相比,組織中n-3脂肪酸含量和n-3與n-6脂肪酸比值均升高;老年 fat-1

4、轉(zhuǎn)基因大鼠與野生型大鼠相比,在血液學參數(shù)以及自主活動等方面均有顯著變化。我們認為,這些特點能讓fat-1轉(zhuǎn)基因大鼠成為比fat-1轉(zhuǎn)基因小鼠更顯優(yōu)勢的疾病研究模型,能應用到生理活性與病理機制的探討研究中。
　　我們還嘗試對建立的細胞系進行體外誘導分化,經(jīng)過25天以上多階段不同條件培養(yǎng)及不同因子誘導后,發(fā)現(xiàn)該分化細胞進入減數(shù)分裂并形成卵母細胞透明帶以及卵母細胞所特有的GV結構。這是首次應用雌性生殖干細胞直接向卵母細胞誘導分化。雖然未