小鼠臍帶間質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性研究.pdf

1、目的:建立小鼠臍帶來源的間質(zhì)干細(xì)胞(mouse umbilicalcord-derived mesenchymal stem cells，mUC-MSCs)的分離培養(yǎng)方法，分析其生物學(xué)特性，并比較其與小鼠骨髓來源的間質(zhì)干細(xì)胞(mousebone marrow-derived mesenchymal stem cells, mBM-MSCs)的差異，初步探討Toll樣受體3(TLR3)對(duì)mUC-MSCs特性的影響。
　　方法:采用改

2、良組織塊貼壁法分離培養(yǎng)mUC-MSCs，在含有15％胎牛血清的F12/DMEM培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)、純化及傳代擴(kuò)增。采用全骨髓貼壁法分離獲得mBM-MSCs。通過細(xì)胞形態(tài)觀察、生長曲線繪制、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)及成脂/成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，分別對(duì)mUC-MSCs和mBM-MSCs進(jìn)行形態(tài)學(xué)、生長特性、細(xì)胞周期、免疫表型(CD29、CD34、CD45、CD44和CD11b)和多向分化潛能的比較分析;采用Western blot檢測(cè)長期培養(yǎng)中mUC-MSCs

3、干性相關(guān)蛋白(Oct4、Sox2、Sall4和Nanog)表達(dá)水平的改變，并比較mUC-MSCs和mBM-MSCs中干性相關(guān)蛋白（Oct4、Sox2、Sall4、Nanog和β-catenin）表達(dá)的差異;qRT-PCR分析兩者間9種炎癥相關(guān)因子、成脂分化相關(guān)分子Adiponectin和成骨分化相關(guān)分子Runx2的基因表達(dá)差異。以Poly(I∶C)作為TLR3的激動(dòng)劑，綜合運(yùn)用Western blot、細(xì)胞平板克隆實(shí)驗(yàn)、液相芯片(Lum

4、inex)分析和qRT-PCR評(píng)價(jià)Poly(I∶C)預(yù)處理對(duì)mUC-MSCs的干性蛋白表達(dá)、克隆增殖能力、細(xì)胞因子分泌及其基因水平表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:mUC-MSCs原代培養(yǎng)6-12天進(jìn)行首次傳代，傳至第5至第7代時(shí)純化，形態(tài)均一，呈長梭形，至20代時(shí)細(xì)胞形態(tài)無明顯改變。mUC-MSCs在長達(dá)60次的傳代培養(yǎng)中，其4種干性相關(guān)蛋白（Oct4、Sox2、Sall4和Nanog）的表達(dá)呈一致性的先升高后降低的趨勢(shì)，30代以內(nèi)細(xì)胞的

5、細(xì)胞周期無明顯改變，依然維持較高的增殖潛能。mUC-MSCs與mBM-MSCs形態(tài)相似，而前者更易純化;生長曲線和細(xì)胞周期的檢測(cè)顯示mUC-MSCs的增殖能力低于mBM-MSCs;流式分析表明，兩者均表達(dá)干細(xì)胞標(biāo)記CD29和CD44，不表達(dá)造血標(biāo)記CD34、CD45和單核/巨噬細(xì)胞標(biāo)記CD11b;兩者均具有成脂和成骨分化潛能，且mUC-MSCs的分化效率明顯低于mBM-MSCs;mUC-MSCs中Oct4、Sox2、Nanog和Sall

6、4的蛋白表達(dá)顯著強(qiáng)于mBM-MSCs，與β-catenin的表達(dá)相反;mBM-MSCs中IL-6、IL-1β、TNF-α、COX-2、iNOS和CCL5的基因表達(dá)都明顯高于mUC-MSCs。mUC-MSCs經(jīng)Poly(I∶C)預(yù)處理后，其干性蛋白表達(dá)和克隆增殖能力均增強(qiáng)，IL-6、IL-8、CCL5和CXCL10的基因表達(dá)顯著增強(qiáng)，且IL-6、CXCL10和MCP-1的分泌增加。
　　結(jié)論:成功建立了mUC-MSCs的分離培養(yǎng)方法