絲素蛋白基共混納米纖維的制備及在軟組織修復(fù)中的應(yīng)用.pdf

1、在生命系統(tǒng)中，細(xì)胞外基質(zhì)在調(diào)控細(xì)胞行為中起著重要的作用，為細(xì)胞的黏附、增殖、遷移和分化提供具體的配體。作為組織工程的支架材料，最佳的設(shè)計(jì)應(yīng)該盡可能地仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)。人體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)是由膠原蛋白和糖氨聚糖(GAGs)交聯(lián)而成的納米纖維凝膠網(wǎng)絡(luò)，纖維直徑為50-500nm。靜電紡絲可以制備幾十納米到幾微米的超細(xì)纖維，制備的納米纖維支架可以仿生天然細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)，具有高的比表面積、高的孔隙率，有利于細(xì)胞的黏附、增殖、遷移和分化。絲素蛋白

2、是一種資源豐富的天然蛋白質(zhì)，由于其具有良好的生物相容性、生物可降解性、良好的透氣、透濕性、無免疫原性等優(yōu)異的性能被廣泛用于組織工程領(lǐng)域。然而單一組分的絲素蛋白納米纖維脆性大，柔韌性差，作為用于軟組織修復(fù)（如皮膚、血管、神經(jīng)導(dǎo)管等）的支架材料，難以滿足其力學(xué)性能的要求，尤其對于力學(xué)性能要求較高的血管和神經(jīng)導(dǎo)管等管狀支架。同時，作為組織修復(fù)的支架材料，最佳的設(shè)計(jì)應(yīng)該是從結(jié)構(gòu)、組成上仿生細(xì)胞外基質(zhì)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)功能上仿生。
　　本課題從仿生

3、天然細(xì)胞外基質(zhì)的角度出發(fā)，首先采用靜電紡的方法制備了絲素蛋白(SF)/羥丁基殼聚糖(HBC)共混納米纖維并對其性能進(jìn)行了研究。掃描電鏡(SEM)顯示隨著共混物中HBC的含量從20％增加到100％，纖維的直徑逐漸減小。通過紅外光譜(FTIR)、13CCP/MAS核磁共振(13CCP/MASNMR)分析，發(fā)現(xiàn)SF與HBC分子間存在一定的相互氫鍵作用，然而HBC的加入沒有誘導(dǎo)SF的構(gòu)象從無規(guī)線團(tuán)轉(zhuǎn)變成β-折疊結(jié)構(gòu)。X-射線衍射(XRD)分析發(fā)

4、現(xiàn)SF與HBC共混后，出現(xiàn)了新的結(jié)晶峰，且結(jié)晶度提高，進(jìn)一步說明HBC和SF分子間有一定的相互氫鍵作用。熱重分析(Tg)的結(jié)果表明與純的HBC靜電紡納米纖維膜相比較，共混后熱穩(wěn)定性有所提高。靜電紡納米纖維膜的親水性隨著共混物中HBC含量的增加而減小，但仍保持良好的親水性能。力學(xué)性能的結(jié)果表明，當(dāng)SF和HBC的質(zhì)量比為20∶80時，斷裂強(qiáng)度和斷裂伸長率都明顯地提高，力學(xué)性能有所改進(jìn)。
　　為了改善SF/HBC共混納米纖維膜在體內(nèi)和體

5、外的穩(wěn)定性，用京尼平蒸氣作為交聯(lián)劑，戊二醛和乙醇蒸氣作比較，對SF/HBC共混納米纖維膜進(jìn)行了交聯(lián)并對其性能進(jìn)行了研究。通過對交聯(lián)后以及在去離子水中浸泡4天后的靜電紡納米纖維膜的SEM觀察，結(jié)果表明京尼平蒸氣交聯(lián)的合適時間為24h，同時，戊二醛蒸氣交聯(lián)24h后的纖維膜也具有良好的水抵抗性，而乙醇蒸氣處理24h后的靜電紡纖維膜浸泡后不能保持纖維的結(jié)構(gòu)。孔徑和孔隙率的測試結(jié)果表明京尼平蒸氣和戊二醛蒸氣交聯(lián)的納米纖維膜比乙醇蒸氣處理的納米纖維

6、膜平均孔徑和孔隙率要大。不同質(zhì)量比的SF/HBC共混納米纖維膜用京尼平蒸氣交聯(lián)后，應(yīng)變都稍有下降，應(yīng)力都有明顯地提高，且比相同條件下戊二醛蒸氣交聯(lián)、乙醇蒸氣處理后的力學(xué)性能更好。交聯(lián)后共混納米纖維膜的親水性略有下降。衰減全反射傅立葉紅外光譜(FTIR-ATR)和13CCP/MASNMR表征結(jié)果顯示京尼平和戊二醛都能作為交聯(lián)劑與SF和HBC發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，且京尼平能使SF的構(gòu)象從無規(guī)線團(tuán)轉(zhuǎn)變成β-折疊。
　　通過內(nèi)皮細(xì)胞在不同質(zhì)量比的

7、SF/HBC納米纖維膜支架的增殖情況及細(xì)胞形貌觀察對細(xì)胞相容性進(jìn)行了評價，結(jié)果表明細(xì)胞在純的SF和不同質(zhì)量比的SF/HBC納米纖維膜支架的增殖速率高于或接近培養(yǎng)板(TCP)。而純的HBC納米纖維支架略差一些。從長時間細(xì)胞培養(yǎng)來看，京尼平蒸氣交聯(lián)的SF/HBC納米纖維膜支架比戊二醛蒸氣交聯(lián)更有利于細(xì)胞的增殖。SEM觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞能在純的SF及不同質(zhì)量比的SF/HBC納米纖維支架上更好的黏附和擴(kuò)散。京尼平蒸氣交聯(lián)的SF/HBC納米纖維膜支

8、架作為皮膚缺損修復(fù)動物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明其具有良好體內(nèi)相容性，能促進(jìn)傷口的愈合。從長遠(yuǎn)考慮，京尼平也許是一種交聯(lián)SF/HBC共混靜電紡納米纖維更理想的方法。
　　由于SF和HBC都是天然材料，共混后力學(xué)性能仍然較差，難以滿足力學(xué)性能要求較高的血管、神經(jīng)導(dǎo)管等管狀支架的要求。因而將SF與力學(xué)性能優(yōu)良的聚乳酸-聚己內(nèi)酯共聚物(P(LLA-CL)(50∶50)共混靜電紡成納米纖維。SEM的結(jié)果顯示纖維直徑隨著P(LLA-CL)含量的增加而增

9、大，在共混比例相同時纖維直徑隨溶液總濃度的增加而逐漸增大。通過X-射線光電子能譜(XPS)、FTIR及固態(tài)13CCP/MASNMR分析表明SF主要分布于纖維的表而，并且SF和P(LLA-CL)沒有發(fā)生明顯的共價鍵作用，仍保持了為細(xì)胞提供結(jié)合位點(diǎn)的生物功能基團(tuán)。隨著SF含量的逐漸增加，納米纖維膜的親水性逐漸增強(qiáng)，與純SF及P(LLA-CL)納米纖維膜相比較，SF/P(LLA-CL)共混納米纖維膜的力學(xué)性能得到明顯地改善，且可以通過兩者的比

10、例裁剪以滿足不同支架材料的力學(xué)性能的需要。
　　在模擬體內(nèi)環(huán)境37℃PBS緩沖液（7.4±0.1）的條件下，對SF/P(LLA-CL)共混納米纖維膜的體外降解性能進(jìn)行了探討。通過對降解不同時間后納米纖維膜的失重、降解液的pH值變化、納米纖維膜的形貌觀察、熱分析(DSC、TG)、XRD及FTIR-ATR等一系列的分析和表征，研究結(jié)果表明純的SF靜電紡纖維膜基本上不降解，純的P(LLA-CL)靜電紡纖維膜降解最快。同時，SF/(PLL

11、A-CL)共混靜電紡纖維膜的降解研究發(fā)現(xiàn)SF的加入，使P(LLA-CL)的降解速率降低。其主要原因可能是SF與P(LLA-CL)存在較強(qiáng)的分子間相互作用力阻礙了P(LLA-CL)分子鏈的運(yùn)動。
　　以內(nèi)皮細(xì)胞為種子細(xì)胞，研究了SF/P(LLA-CL)共混納米纖維膜的細(xì)胞相容性，而且以新西蘭兔為動物模型，采用皮下植入法，研究了不同比例SF/P(LLA-CL)共混納米纖維膜在體內(nèi)的組織相容性。MTT結(jié)果顯示，含有SF的納米纖維支架比純

12、的P(LLA-CL)納米纖維支架更有利于內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，并且與純的P(LLA-CL)納米纖維支架相比，SF/P(LLA-CL)共混納米纖維支架更能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，尤其當(dāng)SF/P(LLA-CL)的比例為25∶75時，更有利于內(nèi)皮細(xì)胞的生長。SEM觀察發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細(xì)胞在共混納米纖維上能更好的擴(kuò)散形成內(nèi)皮單層。皮下植入實(shí)驗(yàn)的結(jié)果說明不同比例的SF/P(LLA-CL)共混納米纖維支架具有良好的體內(nèi)組織相容性。
　　采用高速旋轉(zhuǎn)滾筒接收裝置

13、制備了取向SF/P(LLA-CL)(25∶75)納米纖維并研究了其與雪旺細(xì)胞的相互作用。滾筒旋轉(zhuǎn)速率對纖維取向度及直徑影響的研究發(fā)現(xiàn)，隨著旋轉(zhuǎn)速率的逐漸增加，取向度逐漸增大，而纖維直徑?jīng)]有明顯的變化。力學(xué)性能測試的結(jié)果表明，取向納米纖維膜的力學(xué)性能存在各向異性，在纖維平行方向的斷裂應(yīng)力比纖維垂直方向的斷裂應(yīng)力大的多。對雪旺細(xì)胞在取向、無規(guī)的靜電紡纖維膜上的增殖和細(xì)胞形態(tài)進(jìn)行了研究。增殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明雪旺細(xì)胞在SF/P(LLA-CL)取向

14、和無規(guī)靜電紡纖維上增殖均高于取向和無規(guī)的P(LLA-CL)靜電紡纖維上的增殖，且細(xì)胞在取向SF/P(LLA-CL)納米纖維上的增殖要高于無規(guī)SF/P(LLA-CL)納米纖維上的增殖。通過SEM觀察細(xì)胞的形貌，結(jié)果顯示在取向SF/P(LLA-CL)納米纖維上細(xì)胞是沿著纖維方向生長和拉長，并且細(xì)胞與細(xì)胞之間及細(xì)胞與纖維之間很好地融合在一起，而在其它纖維上細(xì)胞呈現(xiàn)為所有方向上擴(kuò)散的形貌。說明取向SF/P(LLA-CL)納米纖維的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)能引導(dǎo)

15、細(xì)胞沿著纖維的方向生長。
　　以SD大鼠作為動物模型，取向SF/P(LLA-CL)(25∶75)納米纖維制成的神經(jīng)導(dǎo)管用于橋接大鼠坐骨神經(jīng)10mm缺損。P(LLA-CL)納米纖維制成的神經(jīng)導(dǎo)管和自體神經(jīng)作為對照組。術(shù)后4周和8周從大體觀察、電生理檢測、組織學(xué)和免疫組織學(xué)分析以及圖像分析等指標(biāo)檢測比較各組坐骨神經(jīng)再生的情況。所有的結(jié)果均表明:取向SF/P(LLA-CL)納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管組再生神經(jīng)纖維的質(zhì)量和數(shù)量均優(yōu)于取向P(LLA-