海水魚類主要弧菌鑒定和毒力基因檢測的膜芯片技術.pdf

1、弧菌廣泛分布于近海及河口的海洋環(huán)境，已經(jīng)證明有多種弧菌是魚類的重要條件性致病菌。弧菌病是引起全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害泛濫、造成巨大經(jīng)濟損失的魚類細菌病?；【闹虏C理與它攜帶幾種重要毒力基因有關，這些毒力基因編碼不同的毒力因子，分別行使不同的功能，共同協(xié)作形成一套復雜的致病機制。在20世紀90年代發(fā)展起來的基因芯片技術，是高通量、微型化和自動化的新型分子生物學技術，是基因功能研究的有力工具。將該技術應用于水產(chǎn)動物病害監(jiān)測，進行快速有效的早期診

2、斷對防治工作來說是很重要的。 采用十字交叉劃線法、點種法和平板擴散法從160株海洋細菌中篩選出1株對鰻弧菌和哈維氏弧菌的生長有一定抑制作用的海洋細菌2004103101。將病原菌接種到2004103101菌的除菌培養(yǎng)上清中，設定對照組，通過在不同培養(yǎng)時間測量培養(yǎng)液的OD<,600>再次確認其培養(yǎng)上清中是否含有抑制病原菌生長的物質。結果顯示，這株菌對兩種病原菌均有一定的生長抑制作用。2004103101菌革蘭氏染色陰性，彎曲短桿狀

3、，TCBS培養(yǎng)基上菌落呈半透明黃色濕潤扁圓形，有較強的體外溶血性，生理生化實驗結果表明該菌與鰻弧菌相似。進一步對其16S rRNA的序列進行PCR測序和構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示2004103101菌與鰻弧菌自然聚類，親緣關系最近。綜合上述結果可將2004103101菌鑒定為鰻弧菌。將這種拮抗菌對大菱鲆進行腹腔注射感染實驗，以注射鰻弧菌和海水魚用生理鹽水分別作為陽性和陰性對照，經(jīng)過14天的觀察和結果分析，結果發(fā)現(xiàn)這株菌的毒力相對于鰻弧菌而

4、言是很低的。為進一步探討其毒力損失原因，針對鰻弧菌的毒力表型相關基因vah，empA，virC，virA，flaA和angM以及16S rRNA設計了7對PCR引物，以鰻弧菌和2004103101菌的基因組DNA為模板進行PCR擴增，發(fā)現(xiàn)與鰻弧菌相比較，2004103101菌缺失與表面抗原合成有關的virC基因，并且angM基因擴增片斷的數(shù)量和大小也與鰻弧菌有一定不同。angM基因是鰻弧菌質粒pJM1和pEIB1所共有的，編碼非核糖體多

5、肽合成酶。 利用基因芯片高通量、平行性的特點，選擇針對各弧菌的16S rRNA、hsp60和2至6個不等的毒力相關基因，設計了由29個探針組成的寡核苷酸芯片和28對基因特異性引物。利用國際生物技術信息中心網(wǎng)站 (http：//www．ncbi．nlm．nih．gov/)進行每個基因序列的BLAST搜索和相關文獻的檢索，檢索到各基因的同源序列后，再將各基因與其同源序列用omiga軟件進行比對，找出保守區(qū)和特異區(qū)，分別處理保存后導入

6、AlleleID 3.0軟件或Array Designer 4.0軟件，設計擴增產(chǎn)物片段長度為200-500bp的引物和長度為45-55bp的探針。將設計好的探針再全部導入omiga軟件進行比對，確定探針之間最多不超過四個連續(xù)堿基相同，而且位置剛好處于引物擴增區(qū)，然后交由基因公司合成。將合成后的探針按照設定的位置分布用手動點樣儀點在尼龍膜上，經(jīng)紫外交聯(lián)后固定在膜上組成寡核苷酸膜芯片。 用酚-氯仿抽提法提取細菌總DNA作為PCR的

7、模板，然后用基因特異性引物加入地高辛標記的(dUTP擴增并標記各菌株的待測目的片段，標記后的PCR產(chǎn)物用1％的瓊脂糖凝膠電泳檢查后測定標記產(chǎn)量，然后配制成20ng/ml的雜交液同時與膜芯片進行雜交，對雜交時間、PCR產(chǎn)物濃度設計梯度試驗以優(yōu)化反應條件，檢測芯片的靈敏度。雜交結束后的反應信號用NBT-BCIP液顯色后進行分析。 試驗結果顯示其中12個毒力相關基因均能特異性顯色，無其它交叉反應，可以作為菌株是否含有該毒力基因的檢測方

8、法，作為菌株是否致病的重要參考指標，而每種弧菌的16S rRNA和hsp60探針點(共10個)則都會與其它一至三種弧菌的16S rRNA、hsp60發(fā)生交叉反應(溶藻膠的hsp60除外)，其反應信號不能作為菌種準確鑒定的依據(jù)，只能作為菌株是否是弧菌的鑒定依據(jù)。試驗中溶藻膠弧菌的omp、副溶血弧菌的trh、費氏弧菌的ampC在PCR反應中能很好的擴增出單一的目的條帶，但在雜交信號中沒有出現(xiàn)顯色反應。試驗中費氏弧菌的omp和cnf,燦爛弧菌