海水養(yǎng)殖源弧菌耐藥性調(diào)查與致病性弧菌毒力基因檢測.pdf

1、由于近些年，盲目的追求高產(chǎn)、超高密度的養(yǎng)殖、技術(shù)混亂、藥物濫用、病害流行、種苗質(zhì)量差、環(huán)境污染等原因，對對蝦的養(yǎng)殖帶來很大的影響。為了探究弧菌在對蝦養(yǎng)殖過程中的流行病學(xué)、耐藥性以及致病性，本研究針對本實(shí)驗(yàn)室保存的上海、江蘇、浙江、福建、海南等地海水養(yǎng)殖中發(fā)病對蝦、魚、蟹等的病料分理出的弧菌對這些弧菌進(jìn)行耐藥性的檢測，利用PCR的方法檢測各個(gè)菌株攜帶整合子的情況，對這些菌株進(jìn)行耐藥基因的檢測，以及運(yùn)用最小抑菌濃度法MIC來研究各個(gè)地區(qū)的弧

2、菌耐藥情況，針對耐藥基因型和耐藥表型對該菌做出正確的判斷，對耐藥株地區(qū)的人工養(yǎng)殖進(jìn)行臨床指導(dǎo)，合理利用抗生素來預(yù)防細(xì)菌性疾病，為臨床指導(dǎo)提供了理論依據(jù)。在沿海5個(gè)省份采集到的患病動(dòng)物和養(yǎng)殖水體等，這些樣品主要采自凡納濱對蝦和青蟹的血淋巴、肝胰腺、肌肉組織等；和分離自鱸魚、舌鰨、大菱鲆、河豚等的體表潰瘍、腸道、腹水和血液樣品。
　　1、耐藥性分析
　　本文主要進(jìn)行了194株弧菌對8種抗生素的MIC值和耐藥基因的檢測，研究了分離

3、菌株的耐藥情況，對耐藥表型和耐藥基因型的相關(guān)性進(jìn)行了比較，簡單的總結(jié)了弧菌在各地區(qū)的耐藥情況。194株菌的MIC值可以看出耐藥率最高的為紅霉素和復(fù)方新諾明，分別為60.8％和58.2%；而對于鏈霉素，則處于中介范圍的菌株較多，有156株；耐藥率最低的藥物為氟苯尼考，僅有7.7%。從不同動(dòng)物分離到的弧菌對8種抗菌藥物的耐藥率有所不同，從魚類分離到的弧菌耐藥率相對較高，蟹類的最低且對氟苯尼考和土霉素耐藥率均為0。還對194株弧菌檢測了1、2

4、、3類整合子和4類整合子所包含的整合酶基因。二類和三類整合酶均未檢測到，一類整合酶檢出率高達(dá)95.4%。194株菌中，其中11株菌均含有一類整合子的保守區(qū)，檢出率為5.67%，但V-69、V-76、V-105這三株菌不但具有完整的整合子，而且還具有可變區(qū)基因盒。對可變區(qū)陽性PCR進(jìn)行T-A克隆測序后分別得到了1308bp、1308bp和1315bp，這三株弧菌含有相同的基因盒，為利福平 ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶（Rifampin ADP-r

5、ibosylating transferase，arr-3）和二氫葉酸還原酶（Dihydrofolate reductase，dfrA27）兩種耐藥基因盒，分別介導(dǎo)利福平和甲氧芐啶耐藥。
　　2、對蝦源副溶血弧菌毒力基因檢測
　　本章對試驗(yàn)室保存的74株對蝦源副溶血弧菌進(jìn)行毒力基因的檢測和最近報(bào)道的副溶血弧菌pirA和pirB基因檢測，和弧菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)T3SS1和T3SS2檢測；并對幾株副溶血弧菌進(jìn)行對蝦感染試驗(yàn)，根據(jù)2

6、4h的半致死濃度LC50，判斷副溶血弧菌的致病性。檢測結(jié)果tdh和trh對基因均未檢測到，而tlh的檢出61株，檢出率為82.4%，T3SS1的檢出率較高，最高的毒力基因VP1670的檢出率最高為62.2%；而T3SS2的檢出率較低，最低的毒力基因VPA1362檢出率為0%。在副溶血弧菌中檢測pirA和pirB毒力因子，檢出率分別為23.0%和20.3%。3、V-76溶藻弧菌多重耐藥和致病性
　　本研究從福建省福清采集的一尾凡納濱

7、病蝦的腸道內(nèi)容物中分離得到一株溶藻弧菌，命名為：V-76。通過凡納濱對蝦回感實(shí)驗(yàn)和微量肉湯稀釋法藥敏實(shí)驗(yàn)來分別研究該菌株的致病性和耐藥性。此外，為了探究V-76的致病性和耐藥性的分子機(jī)制，本文還通過 PCR方法對該菌進(jìn)行了毒力基因、整合子相關(guān)基因和耐藥基因的檢測。凡納濱對蝦回感實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，四組分別注射了3.5×107cfu、3.5×106cfu、3.5×105cfu和3.5×104cfu V-76的對蝦均發(fā)生了死亡，各組的死亡率依次為

8、100%、100%、80%和65%。除了trh、toxR和UreR之外，其它的毒力基因均被檢出，包括tdh、tlh、toxS、Collagenase、FlaA、ompW、AspA和fur。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，V-76對多種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥，如氟苯尼考（32μg.mL-1）、多西環(huán)素（32μg.mL-1）、環(huán)丙沙星（>64μg.mL-1）、氯霉素（128μg.mL-1）、鏈霉素（>512μg.mL-1）、紅霉素（256μg.mL-1）、磺

9、胺甲噁唑（＞2048μg.mL-1）、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑（＞128/2432μg.mL-1）和利福平（>64μg.mL-1）。值得注意的是，V-76對后七種藥物呈現(xiàn)出較高的耐藥水平，而且其新霉素的MIC值也到達(dá)3232μg. mL-1以上。經(jīng)PCR檢測發(fā)現(xiàn)，此菌株攜帶有1類整合子與4類超級(jí)整合子SXT，且該1類整合子包含耐藥基因盒arr2-dfrA27。此外，在菌株V-76中還檢測到1型插入序列共同區(qū)ISCR1，其下游含有一個(gè)氯霉素乙

10、酰轉(zhuǎn)移酶基因cat2。另外，該菌還攜帶有其它耐藥基因，如strA、strB、floR和qnrVC。DNA旋轉(zhuǎn)酶GyrA和拓?fù)洚悩?gòu)酶parC中的位點(diǎn)突變?？稍斐煞Z酮類藥物耐藥，但在上述兩種酶中未發(fā)現(xiàn)氨基酸位點(diǎn)突變。綜上所述，溶藻弧菌V-76能夠?qū)е路布{濱對蝦的發(fā)病死亡，對多種抗菌藥物耐藥，且攜帶多種獨(dú)立基因和耐藥基因。以上結(jié)果表明養(yǎng)殖源弧菌的耐藥性已非常嚴(yán)重，提示我們應(yīng)在水產(chǎn)養(yǎng)殖中規(guī)范抗菌藥物的使用，以達(dá)到控制耐藥菌的出現(xiàn)和擴(kuò)散的目的