硫化氫促血管新生機(jī)制研究——硫化氫靶分子的發(fā)現(xiàn).pdf

1、近年來(lái)，硫化氫(H2S)已經(jīng)從一種有毒、有臭雞蛋氣味的氣體，轉(zhuǎn)變成為繼一氧化氮(NO)、一氧化碳(CO)之后的第三種氣體信號(hào)分子。多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞均能產(chǎn)生H2S。人和大鼠血漿及多數(shù)組織中H2S的濃度約為50μmol/L，而腦中H2S的濃度可以高達(dá)150μmol/L。內(nèi)源性H2S主要由胱硫醚-β-合酶(cystathionineβ-synthase，CBS)或胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionineγ-lyase，CSE)分解L-半

2、胱氨酸產(chǎn)生。CBS主要存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，而CSE主要存在于心血管系統(tǒng)中。內(nèi)源性H2S對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和呼吸系統(tǒng)均有重要的生理調(diào)節(jié)功能。
　　 H2S對(duì)心血管系統(tǒng)存在保護(hù)性作用：舒張血管，降低血壓；對(duì)心臟有負(fù)性肌力作用，并能減輕缺血再灌注引起的心肌損傷；減輕病理情況下血管結(jié)構(gòu)和功能的慢性改變。2007年，本課題組首次發(fā)現(xiàn)H2S新的生物學(xué)活性，即H2S能夠促進(jìn)血管新生。
　　 血管新生，即血管外基質(zhì)降解，血管

3、內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移形成子代血管支的過(guò)程，主要發(fā)生在組織器官生長(zhǎng)，創(chuàng)傷愈合，腫瘤等各種生理、病理過(guò)程中。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF)激活血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體-2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2，VEGFR-2)產(chǎn)生的級(jí)聯(lián)反應(yīng)是血管新生中最核心的信號(hào)通路，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的存活、增殖和遷移。
　

4、　 本課題組首次證實(shí)，H2S能夠促進(jìn)血管新生，該作用依賴于信號(hào)分子Akt(Proteinkinase B，PKB)的磷酸化。時(shí)至今日，并未見(jiàn)其它有關(guān)H2S促血管新生作用的報(bào)道。
　　 H2S促體外血管新生的作用是在猴脈絡(luò)膜.視網(wǎng)膜(內(nèi)皮)細(xì)胞株(RF/6A)上發(fā)現(xiàn)的，該細(xì)胞株在早期發(fā)生過(guò)自發(fā)轉(zhuǎn)化并已傳代540次以上，與原代內(nèi)皮細(xì)胞存在差異，不能完全代表體內(nèi)的血管內(nèi)皮細(xì)胞。H2S是否也能促進(jìn)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Um

5、bilical Vein Endothelial Cells，HUVECs)體外血管新生呢?關(guān)于H2S直接作用的靶分子，至今還沒(méi)有任何報(bào)道，極具挑戰(zhàn)性。我們將在H2S促血管新生機(jī)制的研究中試圖尋找H2S在內(nèi)皮細(xì)胞中的靶分子。
　　 首先，我們研究了H2S對(duì)HUVECs體外血管新生的作用。在H2S的研究中，通常使用NaHS水溶液作為H2S的供體，原代培養(yǎng)的HUVECs在6代之內(nèi)使用。用BrdU摻入法檢測(cè)H2S對(duì)HUVECs增殖的影

6、響，結(jié)果顯示，低濃度NaHS(10μmol/L)能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。用劃痕損傷模型研究H2S對(duì)HUVECs遷移的影響，發(fā)現(xiàn)NaHS(30-200μmol/L)均能顯著促進(jìn)細(xì)胞遷移。內(nèi)皮細(xì)胞體外管腔形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NaHS(30-200μmol/L)均有促進(jìn)HUVECs體外管腔形成的能力。
　　 我們進(jìn)一步探討H2S促進(jìn)HUVECs體外血管新生的機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)，H2S促HUVECs增殖、遷移和管腔形成的作用能夠被VEGFR特異性抑

7、制劑SU5416、PI3K特異性阻斷劑LY294002和HIF-1抑制劑CdCl2(Cadmium Chloride)所阻斷，提示我們H2S可能通過(guò)VEGFR-2/PI3K/Akt，VEGFR-2/FAK信號(hào)通路促進(jìn)血管新生，HIF-1很可能也參與其中。Western blot結(jié)果顯示，NaHS(50μmol/L)能夠提高細(xì)胞中VEGFR-2、PI3K、Akt、FAK的磷酸化水平，且能夠提高HIF-1α的蛋白水平。VEGFR-2信號(hào)通路

8、通常是由VEGF激活，然而Western blot和ELISA結(jié)果顯示，H2S并不能顯著提高內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，細(xì)胞培液中VEGF含量始終小于5 pg/ml，提示VEGF很可能不參與H2S促血管新生的作用。
　　 H2S似乎能夠不依賴于VEGF直接激活VEGFR-2信號(hào)通路。那么，該通路上的信號(hào)分子中有H2S直接作用的靶分子嗎?我們建立了H2S與信號(hào)分子直接反應(yīng)體系，體系中只含有NaHS(0-200μmol/L)、激酶重組

9、蛋白(信號(hào)分子)、激酶底物、緩沖液和ATP，沒(méi)有VEGF和其它細(xì)胞內(nèi)成分。有趣的是，NaHS(30-200μmol/L)能夠直接提高VEGFR-2的磷酸化水平及其激酶活性。H2S也能直接提高VEGFR-1的活性，而對(duì)PI3K、Akt重組蛋白的活性沒(méi)有影響。
　　 我們首次發(fā)現(xiàn)了H2S直接作用的靶分子--VEGFR。為了進(jìn)一步探索H2S與VEGFR之間的相互作用，我們使用AutoDock軟件對(duì)H2S與VEGFR-2進(jìn)行分子對(duì)接研究

10、。結(jié)果顯示，H2S/HS。最有可能結(jié)合在VEGFR-2的activation loop附近和activation loop的自發(fā)磷酸化位點(diǎn)(Y1054)上，而activation loop對(duì)VEGFR-2的激活至關(guān)重要。
　　 總之，我們?cè)贖2S促進(jìn)HUVECs體外血管新生現(xiàn)象及其機(jī)制的研究中，首次發(fā)現(xiàn)了H2S直接作用的靶分子--VEGFR。H2S很可能通過(guò)直接與VEGFR-2的activation loop相互作用，提高受體的