硫化氫治療肥胖性腎損傷的分子機(jī)制.pdf

1、背景：代謝綜合征已成為人類所面臨的主要亞健康問題之一，主要表現(xiàn)為肥胖、血壓升高、甘油三酯升高、心血管疾病、空腹血糖升高、慢性炎癥等多種代謝紊亂。近年來的研究表明代謝綜合癥對(duì)腎臟的功能有一定的損害作用，而腎臟在受損之后又反過來加重了代謝綜合癥的發(fā)展。研究表明：肥胖是代謝綜合征的主要誘因，肥胖不僅能誘發(fā)糖尿病、高血壓及胰島素抵抗（IR），肥胖能夠?qū)е履I臟損傷。由肥胖引起的腎損傷在醫(yī)學(xué)上統(tǒng)稱為肥胖相關(guān)性腎病（ORG）,有報(bào)道稱ORG的臨床表現(xiàn)

2、為血壓升高、血脂升高和微量白蛋白尿出現(xiàn)，病理改變主要為腎小球的體積增大或者腎小球局部出現(xiàn)結(jié)節(jié)性硬化，是腎臟病的早期發(fā)展特征。慢性腎臟?。–hronic kidney diesease，CKD）的防治已成為全球所面臨的重大公共健康問題。2012年，Luxia Zhang等人的調(diào)查報(bào)告指出：在中國，CKD病人的人數(shù)在逐年增加，CKD也已經(jīng)成為了危害公眾健康的重大問題，特別在一些人口密集的農(nóng)村地區(qū)，人數(shù)還在逐年遞增。CKD病人的不斷增加，給全

3、球經(jīng)濟(jì)帶來了巨大負(fù)擔(dān)，因此，尋求可靠的治療方法來改變它的一些危險(xiǎn)因素，如血脂異常，已成為研究CKD的一個(gè)主要方面。硫化氫一直被認(rèn)為是一種有惡臭的毒性氣體，直到1990年，有人證明硫化氫（H2S）可以作為調(diào)節(jié)神經(jīng)功能的一種神經(jīng)遞質(zhì)，能夠由細(xì)胞中的硫化氫合成酶，利用半胱氨酸為原料進(jìn)行合成，硫化氫作為內(nèi)源性的氣體信號(hào)分子才廣泛被人們接受（或認(rèn)知）。隨著對(duì)硫化氫生理功能研究不斷深入，硫化氫對(duì)代謝性疾病的預(yù)防和治療作用的研究也廣泛展開，例如硫化氫

4、對(duì)高血壓的作用，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化的改善已經(jīng)取得了可喜的結(jié)果。硫化氫對(duì)腎臟損傷的研究也已開展了大量的研究，例如在急性腎損傷中，硫化氫對(duì)腎臟損傷的保護(hù)作用研究。然而，硫化氫對(duì)肥胖引起的慢性腎功能損傷是否具有保護(hù)作用還不清楚[5-7]。為此，我們首先用高脂飼料喂養(yǎng)小鼠誘導(dǎo)肥胖，建立腎損傷模型，然后再給予硫化氫，檢測腎功能；腎損傷的發(fā)生常伴著炎癥反應(yīng)，為此，我們檢測炎癥因子和NF-κB信號(hào)途徑，研究炎癥因子在慢性腎損傷中的作用。
　　目的：

5、⑴建立肥胖引起的小鼠慢性腎臟損傷模型；⑵確定硫化氫對(duì)肥胖誘導(dǎo)的小鼠慢性腎損傷具有抗炎作用；⑶分析硫化氫對(duì)肥胖誘導(dǎo)小鼠慢性腎損傷的保護(hù)作用機(jī)制。
　　方法：①所有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都是根據(jù)河南大學(xué)動(dòng)物保護(hù)協(xié)會(huì)和倫理委員會(huì)的道德準(zhǔn)則進(jìn)行的。8周齡C57BL/6雄性實(shí)驗(yàn)小鼠是從南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所購買，在河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院分子醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室的動(dòng)物飼養(yǎng)中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，進(jìn)行分組(低脂飼養(yǎng)組和高脂飼養(yǎng)組)造模和硫氫化鈉（Sodium Hydrosul

6、fide，NaHS，H2S的供體）治療。②小鼠經(jīng)腹腔內(nèi)注射治療后，每隔2日檢查一次小鼠的狀況，如覓食、運(yùn)動(dòng)程度、精神狀態(tài)、皮毛光澤度等情況，并每周監(jiān)測小鼠體重和進(jìn)食、進(jìn)水量的變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)進(jìn)行OGTT檢測，然后處死小鼠，收集血液和組織材料，分別冷凍或固定保存。③小鼠血漿用Cobas8000羅氏全自動(dòng)生化免疫血清工作站檢測分析，主要檢測血漿血液中的半胱氨酸酶抑制劑（又叫胱抑素C，Cys C），尿素（Urea），肌酐（Creatinine

7、），甘油三酯（TG），總膽固醇（TC），高密度脂蛋白（HDL-C），低密度脂蛋白（LDL-C）。然后利用ELISA方法檢測KIM-1指標(biāo)。④利用ELISA方法檢測血清TNF-α和KIM-1指標(biāo)，檢測腎組織勻漿液中的TNF-α、KIM-1、IL-6、MCP-1、IL-10的含量。檢測組織中的甘油三脂（TG）和總蛋白（TP），計(jì)算出腎臟中TG/TP的含量及變化。⑤小鼠經(jīng)用1-3％戊巴比妥鈉鹽針劑麻醉后，先進(jìn)行心臟取血，收集血液，接著取出活體

8、組織。腎臟組織進(jìn)行石蠟切片，切片經(jīng)蘇木精—伊紅染色法( Hematoxylin- eosin staining，HE)染色和PAS（Periodic Acid-Schiff）染色，以及使用Masson染色，觀察腎臟組織損傷，腎小管損傷以及腎小球基底膜變化情況等。⑥取冰凍腎臟組織，提取總的RNA，用RT-PCR進(jìn)行檢測硫化氫合成酶CBS、CSE、3-MST的mRNA表達(dá)變化，檢測TNF-α、IL-6、MCP-1、KIM-1、IL-10等在

9、腎臟中的基因表達(dá)情況。⑦用RIPA裂解腎臟組織，用BCA法進(jìn)行總蛋白定量檢測。Western Blot檢測腎臟組織中NF-κB亞基p50/p65和磷酸化的p65的蛋白含量，以及TNF-α蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：⑴持續(xù)4周腹腔內(nèi)注射硫氫化鈉溶液治療后，與HFD+NS組相比，HFD+NaHS組小鼠的體重減少。⑵持續(xù)4周腹腔內(nèi)注射硫氫化鈉溶液治療后：與LFD+NS組相比，HFD+NS組小鼠的血漿中Cys C、KIM-1、TG、TC含量

10、明顯升高、HDL-C含量降低；與HFD+NS組相比，HFD+NaHS組小鼠的血漿中Cys C、KIM-1、TG、TC含量降低、HDL-C含量升高；血尿素、血肌酸酐四組兩兩相比無明顯差異。⑶持續(xù)4周腹腔內(nèi)注射硫氫化鈉溶液治療后，與HFD+NS組相比，HFD+NaHS組小鼠的腎小球體積變小，鮑曼氏腔隙變寬，腎小球局灶結(jié)節(jié)化等病理變化都有所好轉(zhuǎn)。⑷持續(xù)4周腹腔內(nèi)注射硫氫化鈉溶液治療后：與LFD+NS組相比，HFD+NS組的小鼠腎組織中TNF-

11、α、IL-6、MCP-1的含量升高，RNA表達(dá)水平增加；與HFD+NS組相比，HFD+NaHS組小鼠的腎臟中TNF-α、IL-6、MCP-1的含量降低，基因表達(dá)水平下降，IL-10的分泌量增加和基因表達(dá)水平升高；與HFD+NS組相比，HFD+NaHS組的p65/p50的蛋白表達(dá)含量減少，同時(shí)TNF-α的蛋白表達(dá)含量下降。
　　結(jié)論：硫化氫可以通過下調(diào)p50和p65以及PhosPho-p65的蛋白表達(dá)，抑制炎癥細(xì)胞因子TNF-α和I