大黃、金銀花和甘草對嗜水氣單胞菌致病蛋白及mRNA表達(dá)的影響.pdf

1、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）是引起水產(chǎn)動物細(xì)菌性疾病常見的病原菌，不僅嚴(yán)重威脅著海產(chǎn)品的安全，還帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究從醇提開始，選取乙醇回流提取、大孔吸附樹脂純化、HPLC測定中藥（大黃、金銀花、甘草）主要成分的含量，獲得中藥醇提液；從 MIC、MBC和生長曲線方面，探討中藥醇提液對嗜水氣單胞菌生長的影響；再以SDS-PAGE、2-DE、蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定(MALDI-TOF-TOF-MS)、RT-PCR

2、等研究三種中藥醇提液抑制嗜水氣單胞菌蛋白表達(dá)及其mRNA的轉(zhuǎn)錄，為魚類疾病的預(yù)防和治療提供一種更為經(jīng)濟(jì)安全的途徑。
　　利用傳統(tǒng)的乙醇回流提取法在特定的提取溫度、提取時間、乙醇濃度和料液比提取大黃、金銀花和甘草中的主要成分；并分別用 D101大孔吸附樹脂和聚酰胺樹脂精提上述醇提液；然后用HPLC在設(shè)定的流動相、流速和柱溫下分別測定上述醇提液中主要成分的含量，經(jīng)計(jì)算，得知大黃酸、甘草酸、綠原酸含量分別是2.453 mg/g、3.87

3、9 mg/g、16.376 mg/g生藥。說明采用乙醇回流提取法、大孔吸附樹脂精提能成功提取這三種中藥中的有效成分。
　　為了探索醇提液中主要成分的藥理作用，測定大黃、金銀花、甘草醇提液對嗜水氣單胞菌的MIC、MBC和生長曲線，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種醇提液對嗜水氣單胞菌有著強(qiáng)烈的抑制效果，其MIC、MBC值分別是：1.0 mg/ml、3.9 mg/ml、7.8 mg/ml和4.0 mg/ml、7.8 mg/ml、31.2 mg/ml。從生

4、長曲線圖譜中可以看出，醇提液對嗜水氣單胞菌的生長影響顯著，其遲緩期延長4 h至10 h不等，但延長后部分菌體仍存在對數(shù)期。
　　為了進(jìn)一步探索醇提液抑制嗜水氣單胞菌生長的機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)，使用SDS-PAGE分析菌體總蛋白中差異表達(dá)的蛋白。結(jié)果顯示，與陰性對照組相比，大黃醇提液組、甘草醇提液組和金銀花醇提液組中嗜水氣單胞菌總蛋白均有A、B和C三條差異蛋白未表達(dá)，說明三種醇提液通過抑制嗜水氣單胞菌這些蛋白的表達(dá)以抑制其生長。為了了解蛋

5、白的基本性質(zhì)和特點(diǎn)，使用2-DE將上述三條差異蛋白分離開來并進(jìn)行MALDI-TOF-TOF-MS鑒定。與對照組2-DE圖譜上所有的蛋白點(diǎn)匹配，甘草組上的蛋白點(diǎn)1、金銀花組上的蛋白點(diǎn)2和大黃組上的蛋白點(diǎn)3在同一位置均無匹配點(diǎn)。將三處蛋白點(diǎn)和條帶A挖點(diǎn)酶解后，經(jīng)鑒定獲得四種蛋白酶，分別是：F0F1 ATP synthase subunit beta（F0F1 ATPase-β）、30 S ribosomal protein S1（S1）、E

6、nolasel（NSE）和isocitrate lyase。從文獻(xiàn)中獲知，四種蛋白酶均為代謝酶，表明三種醇提液均是通過抑制嗜水氣單胞菌的代謝以抑制它的生長。
　　三種醇提液除了能在蛋白水平抑制嗜水氣單胞菌代謝酶的表達(dá)，是否能在轉(zhuǎn)錄水平抑制這些酶mRNA的表達(dá)，繼而將醇提液處理后的菌體mRNA進(jìn)行RT-PCR。結(jié)果表明，大黃醇提液和金銀花醇提液能分別抑制isocitrate lyase和F0F1 ATPase-β的mRNA的表達(dá)，但

7、是大黃醇提液和甘草醇提液難以抑制NSE和S1在嗜水氣單胞菌體內(nèi)的表達(dá)。由此說明，大黃和金銀花醇提液可能作為抑制isocitrate lyase和F0F1 ATPase-β的轉(zhuǎn)錄抑制劑而發(fā)揮抑菌效果。
　　綜上所述，本課題研究主要發(fā)現(xiàn)：經(jīng)乙醇成功提取后且含有一定量主要成分的三種中藥醇提液能明顯抑制嗜水氣單胞菌的生長，其抑制效果是通過抑制經(jīng)鑒定的四種蛋白酶的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄而實(shí)現(xiàn)的。所獲研究結(jié)果揭示了大黃、金銀花和甘草作為飼料添加劑并發(fā)揮抗