人PTP1B克隆表達(dá)及豹皮樟總黃酮治療2型糖尿病大鼠部分機制的研究.pdf

1、蛋白酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B）屬于蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶（PTPs）家族，以跨膜受體樣蛋白和胞內(nèi)酶2種形式存在，催化蛋白質(zhì)的磷酸化酪氨酸殘基的去磷酸化反應(yīng)，是哺乳動物體內(nèi)最早被鑒定、純化的PTPs[1，2]。PTP1B作用于胰島素受體(IR)，胰島素受體底物1、2(IRS-1，IRS-2)，生長因子受體結(jié)合蛋白2(Grb2)，磷脂酰肌醇3激酶(PI-3K)等與胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的蛋白，使它們的磷酸化酪氨酸殘基脫磷酸，衰減胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，

2、從而產(chǎn)生受體后的胰島素抵抗[3]。最近有人向小鼠的肝細(xì)胞瘤中導(dǎo)入針對PTP1B的siRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)增強[4]，再次證實了PTP1B在胰島素信號通路中的作用。PTP1B的高表達(dá)除了引起胰島素抵抗外還可引起瘦素抵抗，從而引發(fā)2型糖尿?。═2DM）及肥胖[5，6]。PTP1B基因敲除鼠不僅胰島素敏感性增強，而且去除了PTP1B對胰島素和瘦素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制，使小鼠在高脂飲食條件下也不發(fā)生肥胖，且發(fā)育良好，具有正常的繁殖能力，癌癥

3、的發(fā)生率也未見提高[7]，這提示了PTP1B作為胰島素信號通路的主要負(fù)調(diào)控因子，其小分子抑制劑可能是有效的抗糖尿病/肥胖癥藥物，而且不產(chǎn)生副作用。事實上PTP1B抑制劑已成為胰島素增敏劑的候選藥物之一[8]，全世界有不少實驗室正在從天然中草藥或人工合成的藥物中以PTP1B作為靶點篩選高特異性的抑制劑。PTP1B與肥胖癥、T2DM和腫瘤關(guān)系密切[7]，因此它的大規(guī)模誘導(dǎo)表達(dá)對研究這些疾病有著重要的意義。本研究將PTP1B基因作為T2DM合

4、并肥胖癥的重要候選基因，結(jié)合豹皮樟總黃酮（TFLC）對T2DM大鼠模型的療效及降糖機制研究，為TFLC應(yīng)用于臨床治療肥胖合并2型糖尿病提供前期試驗依據(jù)。主要研究內(nèi)容包括以下四個方面：
　　 ⑴人PTP1B基因cDNA全長的克隆和原核系統(tǒng)表達(dá)。取2型糖尿病人（BMI>28kg·m-2）外周抗凝靜脈血，用淋巴細(xì)胞分離液分離淋巴細(xì)胞，提取總RNA，以O(shè)ligo dT為引物，合成出cDNA第一鏈。以逆轉(zhuǎn)錄（RT）產(chǎn)物為模板，PCR擴增出

5、PTP1B插入片段，連接入克隆載體pMD-18T Vector中構(gòu)建pMD-hPTP1B。設(shè)計帶酶切位點（BamHⅠ，EcoRⅠ）的引物，以pMD-18T Vector作模板進(jìn)行亞克隆，雙酶切后構(gòu)建原核表達(dá)載體pET28a(+)-hPTP1B，氯化鈣法轉(zhuǎn)化入BL21（DE3），IPTG誘導(dǎo)表達(dá)并對誘導(dǎo)劑的濃度、時間及誘導(dǎo)溫度等條件進(jìn)行了優(yōu)化。從2型糖尿病患者外周血中擴增得到1301bp PTP1B cDNA全長序列，經(jīng)雙酶切鑒定及測序分

6、析，表明已成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a(+)-hPTP1B；IPTG的最適誘導(dǎo)濃度為0.05mmol·L-1，最適誘導(dǎo)時間為5h，最適誘導(dǎo)溫度為37℃；Western blot表明表達(dá)的重組融合蛋白具有與天然hPTP1B相同的結(jié)合抗體活性。
　　 ⑵rhPTP1B蛋白的分離純化、酶活性測定以及抑制劑實驗。親和層析法純化rhPTP1B，復(fù)性后用于酶活性測定及抑制劑的實驗。取細(xì)菌裂解上清液經(jīng)Ni2+親和層析柱純化后，利用PTP

7、1B水解特異性底物4-硝基苯基磷酸二鈉鹽(pNPP-Na2)的磷酸基團而產(chǎn)生顏色反應(yīng)來測定rhPTP1B的活性，分析其與rhPTP1B濃度、底物濃度及反應(yīng)溫度的關(guān)系，確定釩酸鈉（Na3VO4，VAN）的抑制類型和豹皮樟總黃酮(TFLC)對rhPTP1B的抑制作用和濃度依賴關(guān)系，并研究2型糖尿病常用治療藥物吡格列酮和二甲雙胍對rhPTP1B有無抑制作用，探討其有無新的降血糖機制。結(jié)果表明誘導(dǎo)表達(dá)純化的rhPTP1B融合蛋白可用于抑制劑的研

8、究：1.rhPTP1B活性隨酶濃度及底物濃度的增加而增加；2.35℃時rhPTP1B的活性最大；3.VAN的抑制作用呈濃度依賴性增強，可能為非競爭性抑制作用；4.TFLC對rhPTP1B有明顯的抑制作用；5.治療2型糖尿病的常用藥物二甲雙胍和吡格列酮對PTP1B酶并無明顯抑制作用，說明這兩種藥物不是通過對PTP1B的抑制起作用的。
　　 ⑶人PTP1B基因的真核系統(tǒng)表達(dá)及在HepG2細(xì)胞的胰島素信號通路中的作用。構(gòu)建真核表達(dá)載體

9、pcDNA3.1-hPTP1B，電穿孔法轉(zhuǎn)染至人肝癌HepG2細(xì)胞，G-418篩選2周后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，檢測rhPTP1B在轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的表達(dá)，免疫熒光法確定表達(dá)的rhPTP1B主要定位在細(xì)胞漿，MTT法初步研究rhPTP1B可能對細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期無顯著影響，免疫沉淀法結(jié)合Western blot檢測其對IRS-1、Irβ的去磷酸化作用，結(jié)果表明rhPTP1B可顯著減少IRS-1、Irβ的磷酸化程度，即明顯衰減胰島素刺激時

10、胰島素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；構(gòu)建了真核沉默載體pBI-dsPTP1B，瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，Western blot檢測PTP1B的被抑制表達(dá)可達(dá)約50％。
　　 ⑷新型2型糖尿病大鼠模型的建立、TFLC的治療及與PTP1B表達(dá)的關(guān)系。用高糖高脂乳劑灌胃雄性SD大鼠5個月，小劑量STZ注射構(gòu)建T2DM模型，分別給予 TFLC （400mg/kg）和陽性對照藥釩酸鈉（VAN，10mg/kg）灌胃治療6周，觀察療效。結(jié)果表明：糖尿病大鼠

11、經(jīng)TFLC治療后空腹血糖（FBG）、糖化血紅蛋白（HbA1c）、胰島素（FINS）、游離脂肪酸（FFA）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白（LDL-C）、胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR）顯著下降，高密度脂蛋白（HDL-C）和胰島素敏感指數(shù)（ISI）明顯提高，胰島β細(xì)胞顯著增生，肝勻漿丙二醛（MDA）含量下降，超氧化物歧化酶（SOD）活性升高；腎、心肌和肝臟的病理學(xué)明顯改善。RT-Real time PCR、Western