豹皮樟總黃酮對(duì)糖尿病血管并發(fā)癥的保護(hù)作用及機(jī)制探討.pdf

1、糖尿病( diabetes mellitus,DM)是一種常見(jiàn)多發(fā)的代謝性內(nèi)分泌疾病,已嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus,T2DM)是各型糖尿病中人數(shù)最多的一種,其各種慢性并發(fā)癥歸根結(jié)底是由血管病變和血管內(nèi)皮功能紊亂引起。
　　近年來(lái),國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者從植物中提取、分離多種具有藥理活性的化合物,其中以黃酮類(lèi)最受重視。安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院的前期研究表明:豹皮樟總黃酮(Total Flavo

2、noids of Litsea Coreana,TFLC)具有降糖降脂的作用。本研究首先通過(guò)高脂灌胃結(jié)合鏈脲佐菌素的注射建立一個(gè)伴胰島素抵抗的2型糖尿病大鼠模型,然后采用TFLC連續(xù)灌胃6周,結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFLC對(duì)伴有胰島素抵抗T2DM大鼠體內(nèi)發(fā)生的血管并發(fā)癥具有一定的保護(hù)作用,其機(jī)制可能與減少腎組織和血管內(nèi)皮細(xì)胞中JNK的磷酸化,改善血管舒縮功能,降低血清炎癥因子濃度,促進(jìn)高糖刺激下血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖,減少細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激等有關(guān)。

3、　　1.伴胰島素抵抗2型糖尿病大鼠模型的建立和評(píng)估
　　目的:建立具有胰島素抵抗(insulin resistance,IR)特征、發(fā)病過(guò)程近似于人類(lèi)2型糖尿病的大鼠模型。
　　方法:將96只6周齡雄性SD大鼠隨機(jī)分為高脂組(High-fat,HF,76只)和對(duì)照組(Normal Control,NC,20只),HF組予脂肪乳連續(xù)灌胃5月(10ml/kg/d), NC組則予蒸餾水灌胃(10ml/kg/d),每周測(cè)體重(bod

4、y mass,BM)。5個(gè)月后測(cè)收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、空腹血甘油三酯(triglyeride,TG)、空腹血糖(fasting blood glucose,FBG)、空腹胰島素(fasting insulin,FIns)等指標(biāo),并計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(insulin sensitivity index,ISI)。隨機(jī)從兩組中各抽取6只,行高胰島素正常血糖鉗夾實(shí)驗(yàn)測(cè)定葡萄糖灌流速率(glucose

5、infusion rate,GIR)的變化,評(píng)價(jià)其胰島素敏感性。HF組的其余大鼠每周給予腹腔注射12mg/kg的鏈脲佐菌素(streptozotocin,STZ)和0.5ml/kg的弗氏完全佐劑(complete Freund's adjuvant CFA),以隨機(jī)血糖>11.1mol/L為2型糖尿病(Type2 diabetes mellitus,T2DM)的成模標(biāo)準(zhǔn),每只大鼠注射最多不超過(guò)3次。測(cè)定成模大鼠24小時(shí)尿微量白蛋白(mi

6、croalbumin,mALB),采用透射電鏡觀察成模大鼠主動(dòng)脈及腎臟內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果:①與NC組相比,高脂灌胃5個(gè)月時(shí)HF組大鼠的BM、SBP、血TG及FIns均顯著升高(P<0.05);ISI明顯降低(P<0.05);FBG升高,但無(wú)顯著性差異(P>0.05)。②HF組GIR水平較NC組明顯下降(P<0.05)。③腹腔注射STZ和CFA后,共有53只大鼠隨機(jī)血糖>11.1mol/L,成模率達(dá)85.5％。④與NC組

7、比較,透射電鏡下可見(jiàn)DM組胸主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞與管壁有分離現(xiàn)象,細(xì)胞內(nèi)部分線粒體空泡變性,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張;腎小球毛細(xì)血管基底膜不均勻增厚,足突大部分融合,系膜增厚結(jié)構(gòu)不清,基底膜局部增厚處見(jiàn)電子致密物沉積,血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)見(jiàn)部分線粒體空泡樣變性。⑤DM組腎臟肥大指數(shù)及24小時(shí)尿mALB水平均明顯高于NC組,差異均有顯著性(P<0.05)。
　　2.豹皮樟總黃酮對(duì)伴胰島素抵抗2型糖尿病大鼠代謝指標(biāo)、炎癥因子及胸主動(dòng)脈血管舒縮功能的影響

8、
　　目的:觀察TFLC對(duì)伴IR的實(shí)驗(yàn)性T2DM大鼠血管內(nèi)皮功能、超微結(jié)構(gòu)及炎癥因子的影響;觀察TFLC對(duì)正常SD大鼠離體胸主動(dòng)脈環(huán)舒縮的影響,并探討其可能的機(jī)制。
　　方法:將伴IR的T2DM模型大鼠隨機(jī)分為DM組、PIO組、TFLC小劑量組和TFLC大劑量組,TFLC組分別予200mg/kg·d、400mg/kg·d灌胃給藥,PIO組予吡格列酮10mg/kg·d灌胃給藥,連續(xù)治療6周。測(cè)定BM、SBP、FBG、糖化血紅蛋

9、白(Glycosylated hemoglobin-A1c, HbA1c)、超敏C反應(yīng)蛋白(high sensitive C-reactive protein,hs-CRP)、一氧化氮(Nitric oxide,NO)、內(nèi)皮素-1(Endothelin,ET-1)、空腹胰島素(Fasting insulin,FIns)等指標(biāo),電鏡觀察胸主動(dòng)脈血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)的變化。建立正常SD大鼠的離體胸主動(dòng)脈環(huán)灌流模型,隨機(jī)分為NC組、TFLC組和P

10、IO組,TFLC組加入不同濃度的TFLC(25、50、100mg/L),PIO組加入10μmol/L的 PIO,觀察TFLC對(duì)離體胸主動(dòng)脈環(huán)舒縮功能的影響。
　　結(jié)果:①與NC組相比,DM組血TG及LDL-C、CRP、ET-1、FBG、HbA1c、FIns、SBP、HOMA-IR水平均顯著上升,NO、ISI水平明顯下降(P<0.05)。TFLC大劑量組和TFLC小劑量組、PIO組的上述各指標(biāo)均較DM組明顯下降(P<0.05)。②D

11、M組胸主動(dòng)脈血管與管壁有分離現(xiàn)象,細(xì)胞內(nèi)部分線粒體空泡變性,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴(kuò)張;TFLC大劑量組和小劑量組、PIO組僅發(fā)生輕度病理改變。③不同濃度的TFLC均可使有完整內(nèi)皮血管環(huán)的基礎(chǔ)張力顯著下降(P<0.05);低濃度的TFLC(25mg/L)即可表現(xiàn)出血管舒張作用,且在一定濃度范圍內(nèi)(25-100mg/L)呈現(xiàn)濃度依賴(lài)性。
　　3.豹皮樟總黃酮對(duì)高糖狀態(tài)下SD大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞JNK信號(hào)通路的影響
　　目的:觀察TFLC對(duì)

12、高糖狀態(tài)下SD大鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖及凋亡、氧化應(yīng)激及JNK信號(hào)通路的影響,初步探討TFLC保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的機(jī)制。
　　方法:將培養(yǎng)的SD大鼠原代血管內(nèi)皮細(xì)胞隨機(jī)分為6組:正常組(Glu5.5mmol/L),高糖組(Glu47.5mmol/L),高糖+PIO組(Glu47.5mmol/L+1×10-6mmol/L PIO),高糖+高劑量TFLC組(Glu47.5mmol/L+TFLC100mg/L),高糖+低劑量TFLC組(Gl

13、u47.5mmol/L+TFLC50mg/L),高糖+SP600125(Glu47.5mmol/L+SP6001251.0μmol/L)。硝酸還原酶法和放射免疫法檢測(cè)各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中NO和ET-1的水平,MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)活性氧簇(Reactive oxygen species, ROS)和細(xì)胞凋亡,Western-blot檢測(cè)JNK、p-JNK蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果:與正常組相比,高糖組中細(xì)胞培養(yǎng)上清NO水平明

14、顯下降,ET-1水平明顯上升,細(xì)胞增殖明顯減少,ROS水平明顯升高,凋亡明顯增加,pJNK水平明顯上升(P<0.01)。TFLC能明顯逆轉(zhuǎn)高糖對(duì)細(xì)胞的各種影響,且呈劑量依賴(lài)性(P<0.05)。
　　4.豹皮樟總黃酮對(duì)伴胰島素抵抗2型糖尿病大鼠腎臟及JNK通路的影響
　　目的:觀察TFLC對(duì)伴IR的T2DM大鼠的腎臟病理變化及c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)蛋白表達(dá)及磷酸化的影響

15、,并探討其保護(hù)T2DM大鼠腎臟的機(jī)制,為T(mén)FLC用于糖尿病合并腎臟病的治療提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:將第一部分建立的伴IR的T2DM大鼠模型隨機(jī)分為模型組(DM)、吡格列酮(pioglitazone,PIO)組、TFLC小劑量和TFLC大劑量組,其中PIO組予吡格列酮10mg/kg·d灌胃給藥,TFLC組分別予200mg/kg·d、400mg/kg·d灌胃給藥。治療6周后分別用HE、PAS、PASM染色觀察各組大鼠的腎臟病理改變;

16、免疫組化、RT-PCR和免疫印跡法分析腎臟組織中JNK的表達(dá)及磷酸化改變。
　　結(jié)果:①3種染色結(jié)果表明:與NC組對(duì)比,DM組的腎小球體積增大,有核細(xì)胞數(shù)增多,囊腔狹小,基底膜不規(guī)則增厚,系膜基質(zhì)增多。TFLC大劑量組、PIO組中的腎小球大小較正常,有核細(xì)胞輕度增生,囊腔狹小,基底膜及系膜基質(zhì)輕度增厚。②免疫組化、RT-PCR和免疫印跡法的結(jié)果表明:DM組腎組織的JNK表達(dá)增高(P<0.05);TFLC和PIO組腎組織的JNK表達(dá)

17、降低(P<0.05),免疫印跡法的結(jié)果發(fā)現(xiàn)TFLC大劑量組的pJNK表達(dá)顯著降低。
　　結(jié)論:
　　1)長(zhǎng)期高脂飲食結(jié)合腹腔注射小劑量STZ和CFA的方法可建立伴有胰島素抵抗、主動(dòng)脈血管和腎血管損害變化、高血脂及高血壓的實(shí)驗(yàn)性T2DM大鼠模型,其發(fā)病過(guò)程近似于人類(lèi)2型糖尿病。
　　2)TFLC治療可明顯改善T2DM模型大鼠胰島素抵抗,降低空腹血糖、糖化血紅蛋白、甘油三酯及收縮壓,抑制炎癥反應(yīng),減輕T2DM大鼠胸主動(dòng)脈及