大豆Gy3亞基cDNA的克隆及離子束介導(dǎo)其轉(zhuǎn)化無(wú)芒雀麥的初步研究.pdf

1、根據(jù)Genbank(M36686)公布的大豆球蛋白基因Gy3亞基的cDNA序列設(shè)計(jì)并合成一對(duì)特異性引物，采用RT-PCR方法從優(yōu)質(zhì)大豆品種黑農(nóng)37號(hào)中獲得約1520bp大小的cDNA片段，將該片段克隆到pMD19-T載體中。經(jīng)測(cè)序顯示該片段含1523個(gè)核苷酸，與Genbank(M36686)公布的大豆球蛋白基因序列同源性為99％，證實(shí)本實(shí)驗(yàn)中克隆的cDNA序列為大豆球蛋白Gy3亞基基因。先提取重組質(zhì)粒pMD19-T/Gy3，然后將重組質(zhì)

2、粒pMD19-T/Gy3經(jīng)YbaⅠ、BazaHⅠ雙酶切的回收產(chǎn)物與植物表達(dá)載體pBll21經(jīng)Xba Ⅰ、BanmHⅠ雙酶切的回收產(chǎn)物連接，從而構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121/Gy3。該表達(dá)載體含有β-Glucuraridase(GUS)報(bào)告基因和卡那霉素(kan)抗性基因，為以后轉(zhuǎn)化體的篩選提供了方便，同時(shí)該載體的成功構(gòu)建為今后利用大豆球蛋白Gy3亞基基因提高牧草等作物的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)奠定了基礎(chǔ)。 在對(duì)離子注入無(wú)芒雀麥種子引起的誘變效

3、應(yīng)的研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，離子能量對(duì)種子存活率有一定的影響，并通過(guò)研究無(wú)芒雀麥種子的成活率和劑量的關(guān)系確定其轉(zhuǎn)化劑量范圍是800、900、1000×2.6×10<'13>Ar<'+>/cm<'2>。 對(duì)離子束介導(dǎo)質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化無(wú)芒雀麥種子的實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)無(wú)芒雀麥的干種子直接注入未能得到瞬間表達(dá)。而在谷運(yùn)紅博士論文中，擬南芥種子萌動(dòng)24～48h后接受注入和轉(zhuǎn)化，瞬間表達(dá)率約10％，本實(shí)驗(yàn)也對(duì)無(wú)芒雀麥種子做了類(lèi)似的處理，確定其轉(zhuǎn)

4、化劑量范圍是300、400、500×2.6×10<'13>Ar<'+>/cm<'2>，卻未能得到理想的結(jié)果。我們對(duì)凍害的防護(hù)問(wèn)題進(jìn)行研究并建立了離子注入愈傷組織的實(shí)驗(yàn)體系。在活體組織注入后可以存活的前提下，通過(guò)對(duì)離子束介導(dǎo)質(zhì)粒DNA導(dǎo)入無(wú)芒雀麥愈傷組織遺傳體系的研究，確定離子束介導(dǎo)無(wú)芒雀麥愈傷組織的轉(zhuǎn)化劑量范圍是2.6、5.2、7.8×10<'15>Ar<'+>/cm<'2>，然后通過(guò)實(shí)際的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)確定最佳轉(zhuǎn)化劑量5.2×10<'15>