大豆Gy3亞基cDNA的克隆及離子束介導其轉化無芒雀麥的初步研究.pdf

1、根據Genbank(M36686)公布的大豆球蛋白基因Gy3亞基的cDNA序列設計并合成一對特異性引物，采用RT-PCR方法從優(yōu)質大豆品種黑農37號中獲得約1520bp大小的cDNA片段，將該片段克隆到pMD19-T載體中。經測序顯示該片段含1523個核苷酸，與Genbank(M36686)公布的大豆球蛋白基因序列同源性為99％，證實本實驗中克隆的cDNA序列為大豆球蛋白Gy3亞基基因。先提取重組質粒pMD19-T/Gy3，然后將重組質

2、粒pMD19-T/Gy3經YbaⅠ、BazaHⅠ雙酶切的回收產物與植物表達載體pBll21經Xba Ⅰ、BanmHⅠ雙酶切的回收產物連接，從而構建了植物表達載體pBI121/Gy3。該表達載體含有β-Glucuraridase(GUS)報告基因和卡那霉素(kan)抗性基因，為以后轉化體的篩選提供了方便，同時該載體的成功構建為今后利用大豆球蛋白Gy3亞基基因提高牧草等作物的營養(yǎng)品質奠定了基礎。 在對離子注入無芒雀麥種子引起的誘變效

3、應的研究過程中發(fā)現，離子能量對種子存活率有一定的影響，并通過研究無芒雀麥種子的成活率和劑量的關系確定其轉化劑量范圍是800、900、1000×2.6×10<'13>Ar<'+>/cm<'2>。 對離子束介導質粒DNA轉化無芒雀麥種子的實驗體系進行了研究，發(fā)現無芒雀麥的干種子直接注入未能得到瞬間表達。而在谷運紅博士論文中，擬南芥種子萌動24～48h后接受注入和轉化，瞬間表達率約10％，本實驗也對無芒雀麥種子做了類似的處理，確定其轉

4、化劑量范圍是300、400、500×2.6×10<'13>Ar<'+>/cm<'2>，卻未能得到理想的結果。我們對凍害的防護問題進行研究并建立了離子注入愈傷組織的實驗體系。在活體組織注入后可以存活的前提下，通過對離子束介導質粒DNA導入無芒雀麥愈傷組織遺傳體系的研究，確定離子束介導無芒雀麥愈傷組織的轉化劑量范圍是2.6、5.2、7.8×10<'15>Ar<'+>/cm<'2>，然后通過實際的轉化實驗確定最佳轉化劑量5.2×10<'15>