陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層對成骨細胞生物活性影響的實驗研究.pdf

1、第一部分:鈦基關(guān)節(jié)假體陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層的制備及表征
　　目的：利用過濾陰極弧沉積技術(shù)制備的涂層具有結(jié)合力強的特性，采用該方法在鈦基假體表面沉積含有硅元素的二氧化鈦涂層及不含硅的單純二氧化鈦涂層，制備二氧化鈦摻硅涂層及二氧化鈦涂層，并檢測其表征。方法：將硅片和鈦片作為陰極等離子源，共沉積于鈦基關(guān)節(jié)假體表面，制備含有硅元素的二氧化鈦涂層，將該涂層與以雙鈦片為陰極源沉積的純二氧化鈦涂層進行對照研究。以掃描電鏡觀察兩種涂層的表面

2、形貌，X射線光電子能譜儀測定兩組涂層的元素組成，X射線衍射儀測定兩組涂層的相組成，自動化接觸角測量儀測量兩組涂層表面的水接觸角、對兩組涂層的可濕性進行分析，并檢測兩組涂層的表面能。結(jié)果：X射線光電子能譜分析顯示，陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層中含有4.6%的硅元素；X射線衍射結(jié)果顯示這兩種涂層可能是無定形態(tài)，鈦基質(zhì)峰顯示清晰；掃描電鏡結(jié)果顯示已摻入的硅元素未顯著改變涂層的表面形貌。二氧化鈦摻硅涂層及二氧化鈦涂層接觸角分別為83±0.74°、

3、94±0.78°，二氧化鈦摻硅涂層的親水性改善。二氧化鈦涂層的表面能明顯低于二氧化鈦摻硅涂層組。結(jié)論：摻硅未明顯改變過濾陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層的表面形貌，但涂層的化學組成發(fā)生改變，改善了涂層的親水性，增加了涂層的表面能；結(jié)合力強的陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層若具有良好的細胞生物活性，將為未來植入物表面改性提供新的選擇，該新型植入物涂層值得進一步研究。
　　第二部分:鈦基關(guān)節(jié)假體陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層對成骨細胞粘附活性的影響<

4、br>　　目的：研究陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層對成骨細胞MG63粘附活性的影響。方法：以二氧化鈦摻硅涂層作為實驗組，單純二氧化鈦涂層作為對照組，以相同的密度在兩組涂層表面分別種植MG63細胞。采用細胞計數(shù)CCK8法分別在1、4、12、24小時檢測粘附于兩組涂層表面的細胞數(shù)目；掃描電鏡于第4、12、24小時觀察成骨細胞在兩組材料表面的鋪展情況；培養(yǎng)2、12小時，進行細胞肌動蛋白張力纖維、細胞核兩重熒光染色，培養(yǎng)12、24小時，進行粘著斑蛋

5、白、肌動蛋白張力纖維、細胞核三重熒光染色，觀察兩組涂層表面細胞局部粘著斑及細胞骨架的分布形態(tài)。結(jié)果：MG63細胞在兩組涂層表面培養(yǎng)1、4小時，CCK8檢測結(jié)果顯示粘附在兩組涂層表面的細胞數(shù)未見顯著差異(P>0.05)；當培養(yǎng)時間延長至12、24小時，CCK8檢測結(jié)果顯示粘附于二氧化鈦摻硅涂層表面的細胞數(shù)量較二氧化鈦涂層表面的細胞數(shù)量顯著增多(P<0.05)；培養(yǎng)2小時，兩組涂層表面細胞肌動蛋白張力纖維熒光染色形態(tài)相似，當培養(yǎng)時間延長到1

6、2、24小時，Si-TiO2涂層表面 MG63細胞肌動蛋白和粘著斑蛋白的分布、表達較二氧化鈦涂層組增強；培養(yǎng)4小時，電鏡觀察兩組涂層表面細胞形態(tài)未見差別；培養(yǎng)12小時，MG63細胞在二氧化鈦摻硅涂層表面?zhèn)巫闵L較二氧化鈦涂層表面細胞偽足更長、更密；培養(yǎng)24小時，二氧化鈦摻硅涂層表面細胞覆蓋面積較二氧化鈦摻硅涂層表面細胞覆蓋面積顯著增加(P<0.05)。結(jié)論：在陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層表面培養(yǎng)的MG63細胞肌動蛋白張力纖維和粘著斑蛋白明

7、顯增強，這促進了細胞骨架重構(gòu)及局部焦點粘附的形成，鈦基關(guān)節(jié)假體陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層可以有效促進成骨細胞MG63的粘附。
　　第三部分:鈦基關(guān)節(jié)假體陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層對成骨細胞增殖、凋亡的影響
　　目的：研究陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層對成骨細胞MG63增殖、凋亡的影響。方法：以二氧化鈦摻硅涂層作為實驗組，單純二氧化鈦涂層作為對照組，分別以相同的密度種植MG63細胞進行培養(yǎng)。細胞培養(yǎng)1、5天后，使用場發(fā)射電鏡分別觀

8、察兩組涂層表面細胞的生長情況；流式細胞儀分析細胞在兩組涂層表面生長1、5天后的細胞存活和凋亡百分比。培養(yǎng)1、3、5天，采用細胞計數(shù)CCK8法分別檢測兩組涂層表面MG63細胞增殖數(shù)量。結(jié)果：電鏡觀察結(jié)果表明，培養(yǎng)1、5天，二氧化鈦摻硅涂層表面細胞增殖數(shù)量較單純二氧化鈦涂層明顯增多。流式細胞術(shù)分析結(jié)果顯示：培養(yǎng)1、5天，在兩組涂層表面培養(yǎng)的MG63細胞存活和凋亡比例未見明顯差異(P>0.05)。CCK8檢測結(jié)果表明，細胞培養(yǎng)1、3、5天，二

9、氧化鈦摻硅涂層表面MG63細胞增殖數(shù)顯著多于單純二氧化鈦涂層表面細胞增殖數(shù)(P<0.05)。結(jié)論：陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層表面培養(yǎng)的成骨細胞MG63增殖數(shù)目較二氧化鈦涂層表面細胞數(shù)目明顯增多，顯示二氧化鈦摻硅涂層能夠有效促進細胞在其表面增殖，而二氧化鈦摻硅涂層與單純二氧化鈦涂層對于在其表面培養(yǎng)的成骨細胞MG63的凋亡未見明顯差異，表明陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層是一種細胞生物活性良好的涂層材料。
　　第四部分:鈦基關(guān)節(jié)假體陰極弧沉

10、積二氧化鈦摻硅涂層對成骨細胞分化活性的影響
　　目的：研究陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層對成骨細胞MG63分化活力的影響。方法：以二氧化鈦摻硅涂層作為實驗組，單純二氧化鈦涂層作為對照組，表面種植相同密度的MG63細胞進行培養(yǎng)。分別于第1、3、5天三個時間點收集標本，檢測兩組涂層表面MG63細胞堿性磷酸酶活性。MG63細胞在兩組涂層表面分別培養(yǎng)3、5天，收集標本進行細胞I型膠原熒光染色，熒光顯微鏡觀察兩組涂層表面成骨細胞MG63的分化標

11、志物I型膠原的表達。細胞在兩組涂層表面培養(yǎng)1、3、5天三個時間點收集標本，采用實時定量RT-PCR法檢測兩組涂層表面MG63細胞I型膠原及骨鈣素的基因表達；采用Western blot法檢測兩組涂層表面MG63細胞I型膠原的蛋白表達。結(jié)果：檢測結(jié)果顯示兩組涂層表面MG63細胞堿性磷酸酶活性隨培養(yǎng)時間的增加均逐漸增高。在培養(yǎng)1天時，兩組涂層表面細胞堿性磷酸酶活性無明顯差異(P>0.05)，但在培養(yǎng)時間延長至第3、5天時二氧化鈦摻硅涂層表面

12、細胞的堿性磷酸酶活性明顯高于單純二氧化鈦涂層組(P<0.05)。熒光顯微鏡觀察，在兩組涂層表面細胞培養(yǎng)至第3、5天時 I型膠原染色結(jié)果顯示，二氧化鈦摻硅涂層表面MG63細胞I型膠原表達豐富，分布廣泛，而單純二氧化鈦涂層表面MG63細胞I型膠原表達量少且稀疏。實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，二氧化鈦摻硅涂層表面MG63細胞I型膠原及骨鈣素基因表達在培養(yǎng)第1天時與對照組無明顯差異(P>0.05)，但在培養(yǎng)第3、5天時二氧化鈦摻硅涂層表面M

13、G63細胞I型膠原及骨鈣素基因表達明顯高于單純二氧化鈦涂層組(P<0.05)；Western blot檢測結(jié)果顯示兩組涂層表面MG63細胞I型膠原蛋白表達在培養(yǎng)第1天時，兩組之間無明顯差異(P>0.05)，但培養(yǎng)至第3、5天時，二氧化鈦摻硅涂層表面MG63細胞I型膠原蛋白表達量明顯較單純二氧化鈦涂層組增高(P<0.05)。結(jié)論：與陰極弧沉積二氧化鈦涂層相比，二氧化鈦摻硅涂層通過增加堿性磷酸酶活性，上調(diào)骨鈣素基因、Ⅰ型膠原纖維基因和蛋白表

14、達促進MG63細胞分化，表明陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層是一種生物活性良好的涂層材料。
　　第五部分:鈦基關(guān)節(jié)假體陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層促進成骨細胞粘附活性的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道
　　目的：研究陰極弧沉積二氧化鈦摻硅涂層對成骨細胞MG63粘附活性影響的可能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通道。方法：以二氧化鈦摻硅涂層作為實驗組，單純二氧化鈦涂層作為對照組，表面種植相同密度的MG63細胞進行培養(yǎng)。分別于細胞培養(yǎng)后第1、4、12、24小時四個時間點收集標本，

15、采用實時定量RT-PCR法檢測兩組涂層表面MG63細胞整合素β1、粘著斑激酶基因表達；細胞培養(yǎng)后于第4、12、24小時三個時間點收集標本，Western blot法檢測兩組涂層表面MG63細胞粘著斑激酶、粘著斑激酶磷酸化蛋白表達。結(jié)果：實時定量 RT-PCR法檢測顯示，細胞培養(yǎng)1、4小時，兩組涂層表面MG63細胞整合素β1基因表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，細胞培養(yǎng)12、24小時，二氧化鈦摻硅涂層表面 MG63細胞整合素β1基因表達顯

16、著高于單純二氧化鈦涂層組(P<0.05)；細胞培養(yǎng)1小時，兩組涂層表面MG63細胞粘著斑激酶基因表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，細胞培養(yǎng)4、12、24小時，二氧化鈦摻硅涂層表面MG63細胞粘著斑激酶基因表達顯著高于單純二氧化鈦涂層組(P<0.05)；細胞培養(yǎng)4小時，Western blot法檢測顯示兩組涂層表面MG63細胞粘著斑激酶、粘著斑激酶磷酸化蛋白表達無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，細胞培養(yǎng)時間延長至12、24小時，二氧化鈦摻硅涂