澤瀉FPPS基因克隆及提高其藥用成分含量的研究.pdf

1、本研究以福建道地藥材澤瀉為材料，采用同源克隆和快速cDNA末端擴(kuò)增技術(shù)克隆澤瀉三萜類化合物合成途徑中的關(guān)鍵酶——法尼基焦磷酸合酶基因的保守序列以及全長(zhǎng)，為法尼基焦磷酸合酶在澤瀉植物體內(nèi)的作用機(jī)理以及基因控制與表達(dá)提供了理論依據(jù)，并可以為利用基因工程改造中草藥的品質(zhì)奠定基礎(chǔ)。對(duì)澤瀉葉面噴施不同類型、不同濃度的誘導(dǎo)子，檢測(cè)澤瀉主要藥用成分23-乙酰澤瀉醇B含量的變化，可以揭示不同濃度的誘導(dǎo)子對(duì)澤瀉中的23-乙酰澤瀉醇B合成的影響，以期通過誘

2、導(dǎo)子的篩選，來更好地提高澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的合成。這些研究為進(jìn)一步提高澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量提供了重要的理論依據(jù)和技術(shù)支撐，同時(shí)也為今后23-乙酰澤瀉醇B擴(kuò)大生產(chǎn)提供了資源保障。經(jīng)過分析，得到以下結(jié)論：
　?。?）本實(shí)驗(yàn)克隆的法尼基焦磷酸合酶基因FPPS的保守序列和全長(zhǎng)序列。FPPS基因保守序列是一個(gè)585bp的通讀的開放閱讀框，編碼了195個(gè)氨基酸。FPPS基因全長(zhǎng)序列1541個(gè)bp，翻譯起始位點(diǎn)為147個(gè)堿基處，終

3、止密碼子為TAG，開放閱讀框包括1032bp，可以編碼343個(gè)氨基酸。
　　（2）建立了澤瀉有效藥用成分23-乙酰澤瀉醇B的提取與檢測(cè)體系。采用石油醚超聲處理，輔助旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)提取23-乙酰澤瀉醇B，利用高效液相色譜法檢測(cè)；色譜柱：Waters C18柱（4.6mm×250mm，5μm）；柱溫：室溫；流動(dòng)相：乙腈-水（80:20）；流速：0.8mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：208nm。
　?。?）50、100和150μg/mL水楊酸處

4、理對(duì)澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，150μg/mL水楊酸處理與對(duì)照處理相比達(dá)到了差異極顯著水平，100和50μg/mL水楊酸處理與對(duì)照處理相比未達(dá)到差異顯著水平。200μg/mL水楊酸處理對(duì)澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量具有抑制作用，未達(dá)到差異顯著水平。
　　（4）50、100和150μg/mL赤霉素處理對(duì)澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，100μg/mL赤霉素處理與對(duì)照處理相比達(dá)到了差異極顯著水

5、平，150和50μg/mL赤霉素處理與對(duì)照處理相比未達(dá)到差異顯著水平。200μg/mL赤霉素處理對(duì)澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B含量具有抑制作用，未達(dá)到差異顯著水平。
　?。?）50、100和150μg/mL脫落酸處理對(duì)澤瀉中23-乙酰澤瀉醇B的含量具有明顯的促進(jìn)作用，150μg/mL脫落酸處理與對(duì)照處理相比達(dá)到了差異極顯著水平，100和50μg/mL脫落酸處理與對(duì)照處理相比未達(dá)到差異顯著水平。200μg/mL脫落酸處理對(duì)澤瀉中23-乙