毛竹赤霉素相關(guān)基因的克隆及輻射對其表達(dá)的影響.pdf

1、毛竹成材早、生長快、輪伐期短、產(chǎn)量高,是中國竹林中分布范圍最廣、面積最大,用材最多的竹種。然而,由于毛竹開花在時間和空間上具有不確定性,且開花后植株便會大片死亡,很大程度上限制了對其有性雜交育種工作的開展,人們開始嘗試誘變育種。本文選取不同劑量的60Coγ射線輻射處理毛竹種子,研究不同劑量輻射和毛竹種子萌發(fā)過程中GA3和IAA的含量的關(guān)系,同時克隆并分析了赤霉素合成酶基因GA20-氧化酶基因,并通過qRT-PCR技術(shù)研究了不同劑量輻射對

2、毛竹不同組織中該基因表達(dá)的影響。
　　 (1)通過優(yōu)化預(yù)處理和檢測方法,采用WatersC18反相色譜柱,以磷酸緩沖鹽和乙腈為流動相,外標(biāo)法測定GA3的回收率為78.42％,變異系數(shù)±3.9,IAA的回收率為82.73％,變異系數(shù)為±2.3,保留時間穩(wěn)定,首次建立了毛竹種子中植物內(nèi)源激素的測定方法。運(yùn)用此法測定毛竹種子萌發(fā)過程中GA3和IAA含量的變化,結(jié)果表明,種子萌發(fā)過程中,GA3的含量在2.56-14.75μg/g.FW,

3、總體呈上升趨勢。IAA的含量在2.59-4.02μg/g.FW,呈先上升后下降再上升再下降的趨勢,總體上低于GA3的含量。
　　 得到了不同劑量60Coγ射線輻射后毛竹種子內(nèi)GA3和IAA的變化規(guī)律。劑量在30Gy內(nèi),在培養(yǎng)初始階段0-36h,毛竹種子內(nèi)GA3和IAA含量明顯高于對照,可見15Gy和30Gy劑量輻射促進(jìn)內(nèi)源激素GA3和IAA的合成,輻照劑量高于30Gy時,毛竹種子內(nèi)GA3的含量明顯低于對照,隨著劑量的升高,輻射對

4、毛竹內(nèi)GA3的合成具有顯著的抑制效應(yīng)。IAA的含量在120Gy種子中才表現(xiàn)為明顯低于對照,可見,輻射劑量高于90Gy,對IAA的合成具有明顯的抑制效應(yīng)。
　　 (2)設(shè)計(jì)兼并引物克隆毛竹GA200x基因中間片段,大小為537bp,該片段與水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、小麥(Triticum aestivum)相應(yīng)的氨基酸序列相似性分別為71％、77％、86％,證實(shí)該片段為GA200x基因cDNA序列

5、的一部分。聚類分析表明,此片段基因編碼的蛋白質(zhì)序列與玉米的最近。通過RACE-PCR技術(shù)獲得PheGA200x基因5’末端。
　　 PheGA200x基因?qū)崟r熒光定量的結(jié)果顯示,輻射劑量為15Gy時,在胚芽和葉中,PheGA200x基因相對表達(dá)最低,而在胚根、莖和根中,基因的表達(dá)高于對照低于30Gy。當(dāng)輻射劑量為30Gy時,除葉外,在其他組織中,PheGA20ox基因的相對表達(dá)處于最高水平,表明30Gy劑量的輻射處理對毛竹的生長