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文檔簡介
1、由于先天性的和創(chuàng)傷性的原因,我國有大量的骨缺損患者,這其中不少患者屬于大塊骨缺損,靠自身能力不能完全修復,需要植入骨修復材料。因此,構建具有優(yōu)異骨修復功能的骨修復替代材料不僅完全必要,而且十分迫切的。為此,我們選用一種新型促進成骨化合物并復合于合適的載體構建新型骨修復材料并對其骨修復性能進行評價。 當前在促進骨修復的眾多細胞因子研究中,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BoneMorphogenetic Proteins,BMPs)最具代表性。然
2、而,在應用方面,BMPs作為活性蛋白分子,由于植入部位存在易分解、易丟失、作用短效、異體(種)蛋白排斥反應等局限,直至目前仍無商品化的、效果可靠的骨誘導因子可供臨床選擇。即使目前現(xiàn)有的實驗用BMPs,價格也十分昂貴。鑒于此,研究者一直尋找具有骨修復作用的新的化合物,去鐵敏(Desferrioxamine,DFO)是我們最近篩選出來的具有強大促進骨修復作用的化合物。其主要作用機制是抑制低氧誘導因子(Hypoxia-InducibleFac
3、tor-1α,HIF-1α)的降解,而HIF-1α通過誘導促血管生成因子表達,促進骨折愈合過程中血管生成。同時HIF-1α還參與對骨系細胞功能的調(diào)控促進骨形成。我們從7種抑制HIF降解的小分子化合物中篩選出成骨性能最強的DFO,我們體外實驗證實DFO在U20S-HRE-LUC細胞中,可上調(diào)低氧誘導因子反應元件(HRE)的表達,在基質干細胞中(MSCs)中可升高HIF-1α水平,促進VEGF表達,胎鼠跖骨體外培養(yǎng)中,周圍有大量血管生成。前
4、期已有動物實驗證實,在牽張成骨和骨折愈合的動物模型中局部應用DFO科取得滿意的修復效果。 骨修復材料的構建還需要合適的載體,在前期研究的基礎上,我們選擇煅燒骨(True Bone Ceramic,TBC)作為載體,與其它載體材料相比,TBC有如下優(yōu)點:保持了自然松質骨的海綿狀結構,且具有很好的空隙率;由骨礦物質結晶組成,鈣磷比接近正常骨;良好生物相容性和骨傳導性。我們摸索出合適的濃度的DFO復合于TBC構建生物活性新型組織工程化
5、骨—DFO-TBC,對DFO的釋放速度和骨修復性能進行研究。針對這種材料設計,我們進行了以下5個實驗研究。 一、TBC作為骨移植材料的相關研究 探索制備一種新的植骨材料一鍛燒牛松質骨,并研究其理化性能和生物相容性。方法:將新鮮小牛骨制成條狀,經(jīng)煮沸及在氫氧化鈉、雙氧水中浸泡初步脫脂脫蛋白,干燥后入鍛燒爐緩慢鍛燒爐,即制得鍛燒牛松質骨。用液體靜力承重法測定氣孔率,掃描電鏡測定孔徑,材料測試機測抗壓抗折強度,X線衍射測材料成
6、分。通過溶血試驗、微核試驗、全身急性毒性試驗、局部刺激試驗、熱源檢測試驗、體內(nèi)植入試驗等了解材料的生物相容性。結果顯示電鏡下材料微孔互相交通,孔徑250-450μm,孔隙率約為76%,X線衍射分析表明鈣磷約比1.75,接近正常骨,抗壓和抗折載荷分別為83.4±10.6N和89.2+9.7N。材料溶血率為0.521%,在允許范圍,微核試驗陰性,全身急性毒性試驗結果無異常,局部刺激試驗注射部位無水腫紅斑出現(xiàn)、熱源檢測試驗結果符合規(guī)定標準。研
7、究表明鍛燒牛松質骨具有一定的強度,合適的孔徑,微孔互相交通,有可靠的生物安全性,可作為植骨材料,用于臨床。 二、TBC對DFO緩釋作用的體外實驗研究 為了研究TBC作為緩釋載體對DFO的體外緩釋作用,探討DFO-TBC復合物的藥物釋放動力學,將DFO以I125標記,以單純TBC為對照組,以按TBC配比2倍體積5mM DFO的配比將TBC與DFO復合作為實驗組。將DFO-TBC樣條浸入0.01mol/L的磷酸鹽緩沖液中,分
8、別在第1,2,3,4,5,6,7,14,30,60天取緩釋液,用gamma計數(shù)儀分析不同時間的標本中的DFO緩釋量,繪制DFO緩釋曲線,總結藥物釋放動力學規(guī)律。結果顯示:第1~14天,DFO出現(xiàn)快速釋放,釋放曲線呈快速上升直線。第14~30天,DFO釋放處于平臺期,釋放曲線接近一水平直線。第30~60天DFO出現(xiàn)緩慢而持久的釋放,釋放曲線表現(xiàn)為上升之曲線.DFO的50%釋放時間為10.5天,其1,3,5,7,14,30和60天的釋放率為
9、7.71%,19.19%,26.37%,34.67%,67.20%,85.99%和99.99%。提示TBC能對DFO有緩慢而持久的體外緩釋作用,有望充當DFO的緩釋載體,但緩釋速度尚有待提高。 三、TBC對DFO的緩釋作用的體內(nèi)實驗研究: 為了研究TBC作為緩釋載體對DFO的體內(nèi)緩釋作用,探討DFO-TBC復合物在體內(nèi)緩釋DFO的藥物釋放動力學,將DFO以I125標記,以單純TBC為對照組,以按TBC配比2倍體積5mM
10、DFO的配比將TBC與DFO復合作為實驗組。將DFO-TBC樣條經(jīng)過手術置入兔的右側橈骨中段內(nèi),分別在第1,2,3,4,5,6,7,14,30和60天手術取材,用gamma計數(shù)儀分析不同時間的標本中的DFO殘留量,計算出DFO緩釋量,繪制DFO緩釋曲線,總結藥物釋放動力學規(guī)律,并與體外緩釋實驗結果比較。結果顯示:第1~14天DFO出現(xiàn)快速釋放,釋放曲線呈快速上升直線。第14~30天DFO釋放處于平臺期,釋放曲線接近一水平直線。第30~6
11、0天DFO出現(xiàn)緩慢而持久的釋放,釋放曲線表現(xiàn)為上升支曲線。DFO的50%釋放時間為9.5天,其第1,3,5,7,14,30和60天釋放量分別是8.17%、20.18%,27.00%,36.68%,70.32%,88.09%和99.99%。提示TBC能對DFO有緩慢而持久的體內(nèi)緩釋作用,且緩釋速度較體外有較大增快,有望充當DFO的緩釋載體。 四、DFO-TBC的肌肉植入實驗研究 為了研究DFO-TBC植入動物體的成骨生物學
12、行為,為進一步進行DFO-TBC用于骨填充的研究和應用提供理論基礎和方法積累,按TBC配比2倍體積5mM DFO的比例將TBC與DFO復合成DFO-TBC,經(jīng)手術植入于昆明小鼠臀部肌肉袋中。定期取材進行大體觀察、組織切片,觀察材料表面變化、周圍組織有無感染等不良反應、有無骨形成和生物力學指標最大抗壓強度的改變。結果顯示植入后的TBC在體內(nèi)逐漸出現(xiàn)降解,60天時非常明顯。組織切片發(fā)現(xiàn)無新骨生成,最大抗壓強度持續(xù)減低。DFO-TBC植入后可
13、見大量新骨形成,最大抗壓強度持續(xù)升高,60天時升高132.04%。提示:DFO-TBC植入小鼠肌肉內(nèi)未見感染等不良反應,可見骨形成,生物力學強度升高,有較好的連續(xù)性。 五、DFO-TBC修復大塊骨缺損的實驗研究 為了研究DFO-TBC植入動物骨內(nèi)DFO-TBC的降解和新骨替代行為,為將DFO-TBC用于骨填充的研究和臨床應用提供理論依據(jù),按TBC配比2倍體積5mM DFO的配比將TBC與DFO復合成DFO-TBC,經(jīng)手術
14、植入于兔橈骨中段臨界性骨缺損中。術后定期取材進行大體觀察、X線片和組織切片,觀察材料降解和被新骨替代的速度。結果顯示植入后的DFO-TBC在體內(nèi)降解和被新骨替代較單純TBC明顯加快,DFO-TBC植入后30天時X線片影像邊緣明顯不清,有骨痂樣影,60天時輪廓幾近消失。TBC植入后30天密度減低,但仍然外形清楚。組織切片顯示60天后DFO-TBC中間大量新骨形成,而TBC在60天后的降解和被新骨替代只有相當于DFO-TBC在30天以內(nèi)的水
15、平。提示:DFO-TBC植入兔橈骨中段缺損后,其材料降解和被新骨替代明顯加快,且二者始終結合緊密。DFO-TBC是較單純TBC有明顯改進的新型生物活性骨修復材料。 總結以上實驗結果,可以得知:TBC有較好的生物力學強度、微孔結構等理化性能。TBC在體外和體內(nèi)均有DFO的多孔緩釋載體的特性,且在體內(nèi)的緩釋速度較體外明顯加快;DFO-TBC植入小鼠肌肉內(nèi)能誘導骨形成,在修復骨缺損試驗中能明顯加快新骨的生成、長入和材料的降解。DFO-
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