煙粉虱對(duì)高效氯氰菊酯和阿維菌素抗性的生化和分子機(jī)理.pdf

1、一、煙粉虱生物型鑒定 利用西葫蘆接蟲(chóng)法、酯酶同功酶電泳和線粒體細(xì)胞色素氧化酶Ⅰ(mtDNACOⅠ)基因序列比較等方法對(duì)南京(NJ)品系煙粉虱生物型進(jìn)行了鑒定。NJ品系煙粉虱接種西葫蘆后能誘導(dǎo)西葫蘆產(chǎn)生銀葉癥狀，其酯酶同功酶譜與Q型煙粉虱明顯不同，mtDNA COⅠ基因片段序列與B型煙粉虱同源性達(dá)98％以上，這些結(jié)果說(shuō)明NJ品系的生物型為B型。 二、煙粉虱鈉通道基因克隆與抗性相關(guān)突變 檢測(cè)通過(guò)RT-PCR克隆了煙粉

2、虱鈉離子通道結(jié)構(gòu)域Ⅱ S4-6cDNA片段，發(fā)現(xiàn)位于925位亮氨酸到異亮氨酸的突變(L9251)與擬除蟲(chóng)菊酯抗性相關(guān)，并建立了L925Ⅰ突變的PASA檢測(cè)技術(shù)。與SUD-S敏感品系相比，NJ品系對(duì)高效氯氰菊酯有266倍的抗性，采用高效氯氰菊酯對(duì)該種群進(jìn)行多次篩選后獲得NJ-R1品系，對(duì)高效氯氰菊酯的抗性提高到785倍。PASA檢測(cè)結(jié)果表明NJ-R1品系中100％個(gè)體都具有L9251突變(61.1％的個(gè)體為L(zhǎng)925Ⅰ突變純合子，38.9％

3、的個(gè)體為雜合子)，而未篩選的NJ品系只有75％個(gè)體具有L925Ⅰ突變(35％個(gè)體為L(zhǎng)925I突變純合子，40％的個(gè)體為雜合子，25％的野生型)，該結(jié)果表明煙粉虱鈉離子通道L925Ⅰ突變與其對(duì)高效氯氰菊酯的抗性密切相關(guān)。 三、Kdr突變和代謝酶在B型煙粉虱對(duì)高效氯氰菊酯抗性中的相對(duì)作用 NJ品系對(duì)高效氯氰菊酯有266倍的抗性(與SUD-S品系相比)。通過(guò)對(duì)NJ品系進(jìn)行群體篩選和單對(duì)交配篩選分別獲得NJ-R1和NJ-R2品系

4、，其對(duì)高效氯氰菊酯的抗性分別達(dá)到785和2634倍。增效試驗(yàn)表明PBO對(duì)這三個(gè)品系的增效作用均為20倍左右，因?yàn)樵跓煼凼蠵BO即是多功能氧化酶抑制劑，也是酯酶抑制劑，而谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶與抗性無(wú)關(guān)，因此推斷代謝酶在B型煙粉虱對(duì)高效氯氰菊酯的抗性發(fā)展中起到的相對(duì)作用可能為20倍左右，而且這種抗性是B型煙粉虱天生的：TPP(酯酶的專一性抑制劑)對(duì)NJ品系的增效作用為12倍，說(shuō)明PBO增效作用主要是由于抑制酯酶而引起的，即代謝抗性大部分由酯

5、酶所貢獻(xiàn)。在解除代謝酶的作用后(通過(guò)PBO處理)， NJ-R2、NJ-R1和NJ三個(gè)品系對(duì)高效氯氰菊酯的抗性分別為149，40和14倍，這部分抗性由kdr突變所貢獻(xiàn)。這一結(jié)果說(shuō)明kdr突變頻率是B型煙粉虱對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯抗性水平的決定因子，因?yàn)镹J-R2品系為L(zhǎng)925Ⅰ突變純合子，所以推測(cè)kdr突變的最大貢獻(xiàn)可達(dá)約150倍。 四、煙粉虱對(duì)阿維菌素的抗性篩選和抗性生化機(jī)理 采用群體篩選方法，用阿維菌素對(duì)采自南京地區(qū)的B型煙粉虱

6、品系(NJ)連續(xù)篩選18代后獲得一個(gè)對(duì)阿維菌素具有14.5倍抗性的品系(NJ-Abm)。NJ-Abm對(duì)銳勁特沒(méi)有交互抗性，對(duì)吡蟲(chóng)啉和阿維菌素類似物一甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽分別有304倍和4.4倍的交互抗性。與NJ品系相比，NJ-Abm品系的多功能氧化酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性分別提高了2.1和2.0倍。增效劑PBO和DEM對(duì)NJ-Abm品系分別有3.9和4.1倍的增效作用，對(duì)NJ品系的增效作用分別為1.6和1.3倍，TPP對(duì)兩個(gè)品系都沒(méi)

7、有增效作用。這些結(jié)果說(shuō)明多功能氧化酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性上升是煙粉虱NJ-Abm品系對(duì)阿維菌素產(chǎn)生抗性的主要原因。 五、煙粉虱谷氨酸受體基因cDNA的克隆和序列分析 采用RT-PCR和RACE技術(shù)，首次獲得B型煙粉虱谷氨酸受體α亞基cDNA全長(zhǎng)序列，將該基因命名為BtGluCla1。BtGluCla1cDNA序列長(zhǎng)1353bp，編碼450個(gè)氧基酸。 Biast基因樹(shù)顯示BtGluCla1與果蠅谷氨酸受體α亞基同源性最

8、高(81％，NP_732447)，與昆蟲(chóng)谷氨酸受體α亞基親緣關(guān)系較近，與線蟲(chóng)谷氨酸受體亞基親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。Expasy蛋白質(zhì)功能區(qū)分析結(jié)果表明，BtGluCla1亞基包括一個(gè)配基結(jié)合位點(diǎn)，九個(gè)磷酸化位點(diǎn)和構(gòu)成半胱氨酸環(huán)的四個(gè)半胱氨酸殘基位點(diǎn)；TMHMM跨膜區(qū)預(yù)測(cè)結(jié)果表明BtGluCla1亞基有四個(gè)靠近c(diǎn)端的跨膜區(qū)。比較敏感(NJ)和抗性(NJ-Abm)品系BtGluCla1cDNA序列，發(fā)現(xiàn)在NJ-Abm品系中存在8個(gè)氨基酸多態(tài)性位點(diǎn)，N

9、J品系中只有3個(gè)。另外，在NJ和NJ-Abm品系中均存在一個(gè)缺失跨膜區(qū)Ⅳ的谷氨酸受體基因，命名為dBtGluCla1。在NJ品系cDNA中dBtGluCla1出現(xiàn)頻率為20％，在NJ-Abm品系cDNA中dBtGluCluCla1出現(xiàn)的頻率大于80％。單頭煙粉虱成蟲(chóng)BtGluCla1基因組DNA序列分析表明，BtGluCla1和dBtGluCla1由不同的基因編碼，由此推測(cè)抗性和敏感品系dBtGluCla1出現(xiàn)頻率的差異可能是這兩個(gè)基因