重組改構人腫瘤壞死因子對人多藥耐藥SK0V3-DDP細胞的體外作用及其機制的研究.pdf

1、目的：卵巢癌患者對化療產(chǎn)生耐藥性是影響療效的主要原因之一。傳統(tǒng)的逆轉劑因副作用大而使得臨床應用受到限制，因此尋找高效、低毒的逆轉劑是目前研究方向及熱點之一。重組改構人腫瘤壞死因子(recombinant mutant human tumor necrosis factor,rmh-TNF)是由國內學者通過蛋白質工程技術改造天然TNF的結構而研制出的一種高效、低毒的TNF突變體。本研究通過體外實驗觀察rmh-TNF對人卵巢癌多藥耐藥細胞系

2、SKOV3/DDP耐藥性的影響，并對可能存在的機制進行初步的探討，以期尋找一種新的藥物幫助解決卵巢癌治療中出現(xiàn)的多藥耐藥問題。 方法：體外培養(yǎng)人卵巢癌多藥耐藥細胞株SKOV3/DDP，采用四氮唑噻藍鹽(MTT)比色法檢測rmh-TNF對SKOV3/DDP耐藥株的細胞毒作用，選擇殺傷率<10％的濃度作為該藥物的無毒劑量，即本實驗的逆轉劑量。同法測定逆轉劑量的rmh-TNF干預后細胞株SKOV3/DDP對順鉑耐藥性的變化；應用流式細

3、胞術(FCM)檢測rmh-TNF干預不同時間段SKOV3/DDP細胞株中GST-π蛋白、BCL-2蛋白的表達，應用逆轉錄酶鏈反應(RT-PCR)分析rmh-TNF處理SKOV3/DDP細胞前后mdrl mRNA、BCL-2 mRNA的表達水平。 結果： 1、MTT結果顯示：rmh-TNF在(50-3200)U/ml以內能抑制SKOV3/DDP細胞的體外增殖，且隨著濃度增加抑制率相應上升?；貧w分析得出當rmh-TNF終濃度

4、<122.34U/ml，其對細胞生長無明顯抑制作用(細胞存活率均>90％)因此本實驗選用100U/ml作為逆轉劑量。100U/mlrmh-TNF作用SKOV3/DDP 24、48、72h的逆轉倍數(shù)分別為1.19倍、2.20倍、2.64倍。 2、流式細胞術檢測結果顯示rmh-TNF處理前SKOV3、SKOV3/DDP兩組細胞GST-π蛋白表達量的相對值(FI)分別是1、2.33±0.30，兩株細胞GST-π蛋白的表達具有極顯著性差

5、異(P<0.01)，100U/mlrmh-TNF作用細胞SKOV3/DDP 24、48、72h后GST-π蛋白表達量的相對值隨作用時間的延長而逐漸降低，F(xiàn)I值分別為1.82±0.13、1.73±0.28、1.31±0.17，作用前后比較均有顯著性差異(P<0.05)；rmh-TNF處理前SKOV3、SKOV3/DDP兩株細胞BCL-2蛋白表達量的相對值(FI)分別是1、2.62±0.15，兩株細胞BCL-2蛋白的表達具有極顯著性差異(P

6、<0.01)，100U/ml rmh-TNF作用細胞SKOV3/DDP 24、48、72h后BCL-2蛋白表達量的相對值隨作用時間的延長而逐漸降低，F(xiàn)I值分別為2.24±0.20、1.71±0.19、1.30±0.15，作用前后比較均有顯著性差異(P<0.05)。 3、RT-PCR法檢測結果顯示rmh-TNF處理前SKOV3細胞株不表達mdrl mRNA，SKOV3/DDP細胞株mdrl mRNA表達量的相對值(mdrl/β-a

7、ctin)是0.76±0.01。100U/ml rmh-TNF作用細胞株SKOV3/DDP 24、48、72，mdrl mRNA表達量的相對值隨作用時間的延長而逐漸降低，mdrl/β-actin值分別為0.66±0.05、0.52±0.04、0.45±0.03，作用前后差異均有顯著性。(P<0.05)；rmh-TNF處理前SKOV3、SKOV3/DDP兩株細胞BCL-2 mRNA表達量的相對值(BCL-2/β-actin)分別是0.09

8、±0.15、0.47±0.01，兩株細胞BCL-2 mRNA的表達具有極顯著性差異(P<0.01)，100U/ml rmh-TNF作用細胞SKOV3/DDP 24、48、72h后BCL-2 mRNA表達量的相對值隨作用時間的延長而逐漸降低，BCL-2/β-actin值分別為0.45±0.01、0.31±0.01、0.27±0.01，作用前后比較均有極顯著性差異(P<0.01) 結論： 1、重組改構人腫瘤壞死因子(rmh-

9、TNF)在(50-3200)U/ml濃度范圍內，對SKOV3/DDP細胞有生長抑制作用，且呈濃度依賴性。 2、逆轉劑量的重組改構人腫瘤壞死因子(rmh-TNF)對SKOV3/DDP細胞耐順鉑效應有一定的逆轉作用，且逆轉效應存在時間-效應關系。 3、逆轉機制可能為：①逆轉劑量的重組改構人腫瘤壞死因子(rmh-TNF)可能通過下調耐藥相關基因mdrl mRNA表達，進而降低SKOV3/DDP細胞的耐藥性實現(xiàn)逆轉耐藥。②逆轉劑