腫瘤壞死因子α信號在K562細(xì)胞中作用及機(jī)制研究.pdf

1、目的：目前，慢性髓系白血?。–ML）由于酪氨酸激酶抑制劑（TKIs）的使用可以得到很好的治療，但仍存在達(dá)到完全分子學(xué)緩解的患者停藥后復(fù)發(fā)，TKIs耐藥等問題，這些都不能被現(xiàn)行的治療方式控制。因此，尋找BCR/ABL之外治療靶點的問題還亟待解決。腫瘤壞死因子α（TNFα）在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用，其被發(fā)現(xiàn)能夠促使慢性髓系白血病干細(xì)胞生存，但其中的作用及機(jī)制研究還不深入。本研究利用基因編輯技術(shù)CRISPR-cas9，建立背景清晰、同

2、源對照的TNFα敲除人類慢性髓系白血病細(xì)胞模型。利用該模型研究TNFα在CML的效應(yīng)及機(jī)制。
　　方法：本研究中，我們針對人類TNFα基因，挑選合適的靶點，利用CRISPR-cas9技術(shù)設(shè)計基因編輯工具。將工具質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人類慢性髓系白血病細(xì)胞系K562中，利用其表達(dá)后的酶切效應(yīng)實現(xiàn)基因敲除。通過克隆化分選和一代測序，挑選出發(fā)生基因突變的細(xì)胞株。利用RT-PCR和Western-blot方法檢測突變克隆在mRNA和蛋白水平上的變化。

3、將突變克隆株擴(kuò)增后和野生型細(xì)胞進(jìn)行對比，觀察其在體外和體內(nèi)的生物學(xué)效應(yīng)及分泌微泡能力，并對TNFα缺失及野生型細(xì)胞進(jìn)行RNA-seq測序，通過生物信息學(xué)分析初步探討其作用機(jī)制。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建出對TNFα有切割效應(yīng)的CRISPR-cas9工具質(zhì)粒，并獲得超過30株TNFα基因缺失突變的K562細(xì)胞克隆株。在最可能發(fā)生脫靶效應(yīng)的25個位點檢測，并未發(fā)現(xiàn)突變。基因突變克隆在mRNA和蛋白表達(dá)水平上均較野生型下降，且敲除過程沒有對B

4、CR/ABL融合基因造成影響。TNFα基因突變的克隆與野生型對照相比，在伊馬替尼的作用下，凋亡增加；增殖能力下降，集落形成能力受損。在裸鼠皮下成瘤試驗中，突變克隆成瘤的速度和大小均下降。突變克隆的微泡分泌質(zhì)量與野生型并無差異。測序發(fā)現(xiàn)STAT5A信號明顯受抑，且與之相關(guān)的促癌miRNA明顯下調(diào)。
　　結(jié)論：運用基因編輯技術(shù)CRISPR-cas9構(gòu)建基因敲除的人類細(xì)胞模型，背景干凈，方法簡便，敲除效果可靠。TNFα在慢性髓系白血病細(xì)