大熊貓腸道病毒生態(tài)學調(diào)查及部分病毒的遺傳進化與大熊貓源CPV的分離鑒定.pdf

1、大熊貓病毒性傳染病作為大熊貓的重要疾病之一，愈來愈受到人們的重視，在病毒性傳染病中腸道疾病對大熊貓種群危害較大。由于物種限制，對大熊貓腸道易感病毒性疾病的系統(tǒng)性研究還是空白。本研究選取對大熊貓威脅較大的5種易感腸道病毒，即犬瘟熱病毒、犬細小病毒、犬冠狀病毒、輪狀病毒和犬腺病毒作為研究對象，建立其分子生物學檢測方法，并用該方法調(diào)查不同地區(qū)、不同飼養(yǎng)方式以及不同年份的大熊貓攜帶腸道病毒的情況;對調(diào)查為陽性的部分病毒變異基因進行克隆測序，使用

2、生物信息學軟件進行分析，研究其遺傳變異趨勢;采用細胞培養(yǎng)法，對部分陽性樣本進行病毒分離，得到大熊貓源病毒株。本研究主要包括以下幾個方面:
　　1.大熊貓易感腸道病毒分子檢測方法建立
　　根據(jù)GenBank中收錄的大熊貓易感的4種腸道病毒保守基因序列，設(shè)計4對特異性引物，建立了大熊貓易感腸道病毒的分子生物學檢測方法。運用所建立的方法對病毒疫苗株進行擴增，成功擴增出目標條帶，特異性試驗表明其特異性好，敏感性試驗表明其敏感性較高，

3、重復性和穩(wěn)定性試驗表明檢測結(jié)果準確可靠。研究結(jié)果表明，所建立的方法可用于大熊貓易感腸道病毒的臨床診斷和實驗研究。
　　2.大熊貓腸道病毒的生態(tài)學調(diào)查
　　應(yīng)用所建立的4種檢測方法和實驗室原已建立好的大熊貓源輪狀病毒檢測方法對收集于2011年至2013年期間來自于岷山、邛崍、相嶺山系的野生大熊貓及四川地區(qū)圈養(yǎng)大熊貓的188份大熊貓材料，進行分子流行病學調(diào)查。共檢出CDV陽性8份，CPV陽性19份，CCV陽性1份，CAV陽性2份

4、，RV陽性13份。調(diào)查結(jié)果顯示，野生大熊貓的腸道疾病種類數(shù)量及感染率低于圈養(yǎng)大熊貓;2011和2012年期間大熊貓感染腸道病原種類數(shù)量低于2013年;大熊貓腸道病原種類及感染率在5個不同地區(qū)的差異較大，本實驗的研究數(shù)據(jù)豐富了大熊貓腸道病毒生態(tài)學的內(nèi)容。
　　3.大熊貓源部分腸道病毒的遺傳變異分析
　　分別擴增大熊貓源犬瘟熱病毒H基因和細小病毒VP2基因，并進行克隆測序，同時從GenBank下載標準株序列，進行序列比對并構(gòu)建遺

5、傳進化樹進行分析，確定其基因型。對CDV H基因潛在天冬酰胺糖基化位點進行預測，結(jié)果表明大熊貓源犬瘟熱病毒糖基化位點出現(xiàn)變異，屬于Asia-1基因型;對大熊貓源細小病毒進行遺傳變異分析，結(jié)果表明在其VP2基因的第370位氨基酸位點發(fā)生變異，屬于New-CPV-2a基因型。
　　4.大熊貓源部分腸道病毒的分離鑒定
　　對大熊貓細小病毒檢測為陽性的樣品進行病毒的分離培養(yǎng)及鑒定，結(jié)果顯示，該病毒可在MDCK細胞上生長并出現(xiàn)明顯的細