半月板碎塊法移植修復(fù)半月板無血運區(qū)損傷的實驗研究.pdf

1、目的:1.探討皮下埋植不同大小半月板碎塊組織的生物學活性及其差異;2.觀察幼年及成年動物半月板碎塊體外培養(yǎng)與體內(nèi)移植修復(fù)半月板無血運區(qū)損傷的效果。
　　方法:1.取成年家兔雙膝內(nèi)側(cè)半月板，去除周圍1/3，將其中內(nèi)2/3切成不同大小的碎塊:0.5mm×0.5mm×0.5mm（A組）;1.0mm×1.0mm×1.0mm(B組);2.0mm×2.0mm×2.0mm(C組),筋膜包裹后埋植于自體大腿外側(cè)皮下。分別于皮下埋植1、2、3周時取

2、出標本，行活細胞/死細胞熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察細胞遷移;制作石蠟切片，HE染色觀察細胞遷移;皮下埋植3周時，切片行番紅O/固綠染色，Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原及PCNA免疫組化。
　　2.獲取成年豬內(nèi)側(cè)半月板，于其中內(nèi)2/3用環(huán)鋸切取直徑8mm，厚3mm圓柱體標本，于每份標本中央用環(huán)鋸切取直徑4mm，厚3mm中央圓柱體，將取出的中央圓柱體水平等分為上、中、下三份，每份厚1mm。將其中份取出，分別用不同的半月板組織移植替代:幼年豬半月

3、板碎塊（約0.5mm×0.5mm×0.5mm， A組）;幼年豬半月板整塊（B組）;成年豬半月板碎塊（取出的中份切成約0.5mm×0.5mm×0.5mm大小后回植，C組）;成年豬半月板整塊（取出的中央圓柱體中份整塊回植，D組）。移植物與中央圓柱體上、下份組成“三明治”結(jié)構(gòu)后回植。標本進行體外培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)2、4、6周時取出標本，激光共聚焦顯微鏡觀察界面細胞聚集;制作石蠟切片，HE染色，分別觀察移植物周圍界面、碎塊間界面修復(fù)情況;培養(yǎng)6周

4、時，切片行番紅O/固綠染色，天狼星紅染色偏光顯微鏡觀察，Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原免疫組化，分析周圍界面修復(fù)組織成分。
　　3.造成年家兔右膝內(nèi)側(cè)半月板體部無血運區(qū)損傷模型，損傷處分別移植不同的半月板組織:新鮮幼年兔半月板碎塊（約0.5mm×0.5mm×0.5mm，A組）;新鮮幼年兔半月板整塊（B組）;新鮮成年兔半月板碎塊（約0.5mm×0.5mm×0.5mm，C組）;新鮮成年兔半月板整塊（D組）。分別于術(shù)后第4周、8周，取出右膝內(nèi)側(cè)半月

5、板標本行大體觀察及組織學觀察。
　　結(jié)果:1.兔半月板碎塊組織皮下埋植1、2、3周，活細胞/死細胞熒光染色激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示半月板纖維軟骨細胞向碎塊表面遷移，在任意時間點A組至C組均逐漸減弱(P＜0.05)，與碎塊大小呈負相關(guān)性(P＜0.05);各組隨皮下埋植時間增加細胞遷移均逐漸增強(P＜0.05)。HE染色觀察證實細胞向碎塊表面遷移。皮下埋植3周時，Ⅰ型膠原、Ⅱ型膠原免疫組化A組至C組均逐漸減弱(P＜0.05)，與碎

6、塊大小呈負相關(guān)性(P＜0.05); PCNA免疫組化A組強于B組，B組強于C組，A組與C組比較有統(tǒng)計學差異(P＜0.05);番紅O染色各組無顯著性差異(P＞0.05)。
　　2.成年豬半月板標本體外培養(yǎng)2、4、6周，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示移植物周圍界面有細胞聚集，在任意時間點，A組至D組細胞聚集均逐漸減弱(P＜0.05);隨培養(yǎng)時間增加，各組周圍界面細胞聚集均逐漸增加(P＜0.05)。HE染色:移植物周圍界面修復(fù)在任意時間點

7、A組至D組均逐漸減弱(P＜0.05)，碎塊間界面A組均強于C組(P＜0.05);隨培養(yǎng)時間增加，各組移植物周圍界面及A、C組碎塊間界面修復(fù)均逐漸增強(P＜0.05)。體外培養(yǎng)6周時，A、B、C三組移植物周圍界面均有修復(fù)組織，番紅O/固綠染色、天狼星紅染色/偏光顯微鏡觀察、免疫組化均顯示修復(fù)組織中Ⅰ型膠原、Ⅱ性膠原共存。
　　3.兔體內(nèi)實驗中標本大體觀察半定量評分在各時間點A組至D組均逐漸減少(P＜0.05);各組4周至8周界面愈合