高效拮抗水稻白葉枯病菌植物內(nèi)生真菌的選育和防效研究.pdf

1、水稻白葉枯病是我國水稻生產(chǎn)中的四大病害之一，主要是由水稻黃單胞桿菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo)通過水稻葉片的水孔和傷口侵入并于維管束內(nèi)大量繁殖和擴展而引起的一種細菌性病害。當前主要通過施加化學農(nóng)藥如葉枯唑、殺枯凈等藥劑或選育抗性水稻品種的方法。但大量施加化學農(nóng)藥易造成農(nóng)藥殘留，生態(tài)環(huán)境破壞、有益生物被殺等問題。
　　植物內(nèi)生真菌是指寄生在健康植物莖葉中，但對寄主又形成不明顯侵染的一類真菌，其

2、普遍存在于現(xiàn)階段已研究過的水生植物和陸生植物體內(nèi)。相對植物體內(nèi)生物總量而言，內(nèi)生真菌所占比例雖然微乎其微，但是其在整個農(nóng)業(yè)發(fā)展過程中卻發(fā)揮著舉足輕重的作用。除了已被普遍認可的增強植物抗逆性、促進植物生長等作用外，內(nèi)生真菌還能產(chǎn)生異香豆類、生物堿類、殺蟲類、醌類、肽類、酚類等抗菌活性成分物質(zhì)。而這些抗菌活性物質(zhì)能特異性地抑制某些病原菌的生長和繁殖速度，從而達到降低農(nóng)作物病害的目的。因此，現(xiàn)階段從自然環(huán)境中選育一株對水稻白葉枯病菌具有高效拮

3、抗作用的植物內(nèi)生真菌是防治白葉枯病菌病害的一個重要方向。
　　第一，本實驗室從浙江省金華市郊水稻田健康水稻葉片內(nèi)分離獲得一株高效拮抗水稻白葉枯病菌的植物內(nèi)生真菌Bo-1菌株。經(jīng)形態(tài)特征、ITS rDNA序列分析與比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構建，Bo-1菌株被鑒定為淡色生赤殼菌（Bionectriaochroleuca）。生理生化試驗結果表明，Bo-1菌株對碳源、氮源的利用沒有表現(xiàn)出特別的選擇性，并且可以水解明膠、淀粉、尿素、酪蛋白等大分子物

4、質(zhì);對外界環(huán)境的耐受能力測定，發(fā)現(xiàn)Bo-1菌株對酸性和弱堿性環(huán)境以及高、低溫環(huán)境都具有較強的適應能力。
　　第二，選取多種病原菌作為供試菌，測定淡色生赤殼菌（Bionectriaochroleuca）Bo-1菌株的抗菌譜。結果表明:Bo-1菌株發(fā)酵液乙酸乙酯粗提物對多種細菌類病原體都具有較強拮抗能力，其中對白色念珠菌（Moniliaalbican，M..albican）拮抗力最大，抑菌圈直徑達38.9mm。以Xoo作為指示菌，測定

5、淡色生赤殼菌（Bionectria ochroleuca）Bo-1菌株乙酸乙酯提取物抑菌穩(wěn)定性。試驗結果表明，Bo-1菌株的乙酸乙酯提取物抑菌活性隨著溫度的升高而降低，121℃時抑菌圈直徑降至17.6 mm;隨著酸堿性增強，抑菌活性均呈逐步下降趨勢，但在pH2.5和pH10.5下依然保持較高抑菌活性;對于紫外光40 W或普通光源4000 lx光照處理，其保持了穩(wěn)定的抑菌能力。
　　第三，采用單因素試驗測定Bo-1菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)培養(yǎng)所

6、需的最佳碳源、氮源、無機鹽并通過正交試驗對其培養(yǎng)基配方和搖瓶發(fā)酵條件進行優(yōu)化。研究結果表明，Bo-1菌產(chǎn)抗菌物質(zhì)最佳碳、氮源和無機鹽分別為淀粉、蛋白胨、MgSO47H2 O;最佳培養(yǎng)基配方:淀粉30 g/L，蛋白胨2g/L，MgSO47H2O0.5g/L;最佳發(fā)酵條件為:溫度30℃，轉(zhuǎn)速150 r/min，裝液量80 mL/250 mL，pH6.5。
　　第四，盆栽試驗，測定淡色生赤殼菌（Bionectria ochroleuca

7、）Bo-1菌株乙酸乙酯提取物水溶液對水稻白葉枯病的生防效果。采用人工剪葉法侵染4種感病水稻品種，并分別用方法1（先噴藥后接種P6菌）、方法2（先接種P6菌后噴藥）、方法3（只接種P6菌）、無菌水空白對照組共4種不同方法處理水稻葉片。試驗結果表明，水稻葉片病斑抑制率最高達到86.38％，病情指數(shù)最大下降了41.62％，防效作用最大達59.67％。此外，比對試驗中所采用的3種方法不難發(fā)現(xiàn)，方法1的防治效果明顯優(yōu)于其他兩種方法，而方法1主要側

8、重于預防。由上可知，在防治水稻白葉枯病過程中，采取預防手段更為重要。
　　第五，以Xoo P6生理小種作為指示菌進行活性跟蹤，通過分步萃取、硅膠柱層析、高效液相色譜等步驟，分離純化獲得拮抗活性物質(zhì)結晶，對目標物進行核磁共振氫譜分析和質(zhì)譜分析，通過解析與比對，該物質(zhì)分子量為344.0835，分子式為C18H16O7，鑒定為松蘿酸(usnic acid)。將純化的松蘿酸以3％中生菌素和20％葉枯唑為對照，采用96孔板法測定對Xoo P