水稻白葉枯病菌和條斑病菌對噻枯唑和鏈霉素的抗藥性機理研究.pdf

1、水稻白葉枯病和水稻條斑病是水稻上的兩種重要細菌性病害，噻枯唑和鏈霉素則是我國防治這兩種病害的主要藥劑。噻枯唑和鏈霉素在我國使用分別已有30年和50年的歷史，在靶標病原群體中也均已出現(xiàn)抗藥性。因此開展噻枯唑和鏈霉素抗性機理研究，對于抗藥性治理和抗性診斷技術(shù)發(fā)展具有十分重要的意義。本論文圍繞抗性機理進行了以下研究：1.水稻白葉枯病菌抗噻枯唑菌株粘粒基因組文庫構(gòu)建；2.抗噻枯唑水稻白葉枯菌株基因組文庫的活體篩選和基因分析；3.水稻條斑病菌和白

2、葉枯病菌抗鏈霉素分子機理研究；4.水稻白葉枯病菌、條斑病菌、大白菜軟腐病菌以及柑橘潰瘍病菌抗藥基因rpsL的分子檢測。
　　 1.水稻白葉枯病菌噻枯唑抗性菌株粘?；蚪M文庫構(gòu)建
　　 為了探索水稻白葉枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)對噻枯唑的抗性機制，本研究建立了白葉枯病菌噻枯唑抗性菌株2-1-1的粘?；蚪M文庫。通過對2-1-1基因組提取并不完全酶切，回收>23.13kb基因片段

3、，用來自溶源菌BHB2688和BHB2690、效價達1×108pfu/μgDNA的包裝蛋白包裝，感染宿主大腸桿菌S17-1，在含LB+Km+Sp的平板上進行篩選，隨機挑選1200個轉(zhuǎn)化子進行擴增保存，庫容達到2.7倍；隨機挑選15個轉(zhuǎn)化子進行酶切驗證，均有外源片段插入粘粒載體中，插入片段大小23-40kb，成功構(gòu)建了抗噻枯唑白葉枯病菌2-1-1的粘?；蚪M文庫。
　　 2.水稻白葉枯菌噻枯唑抗性菌株基因組文庫的活體篩選和基因分析

4、
　　 將構(gòu)建好的白葉枯病菌噻枯唑抗性菌株2-1-1粘?；蚪M文庫，1200個轉(zhuǎn)化子通過兩親交配轉(zhuǎn)染白葉枯病菌野生敏感菌株P(guān)XO99，獲得的結(jié)合子再剪葉接種經(jīng)300μg/ml噻枯唑處理的稻苗，篩選發(fā)現(xiàn)646、518等2個結(jié)合子表現(xiàn)抗藥性；同時通過在清水對照處理的水稻上篩選，發(fā)現(xiàn)5、33、115、152、119、102、172、519、537、611、643、501、694、518、612、654、308、919、670等多個轉(zhuǎn)化

5、子在致病性上強于2-1-1和PXO99。通過對646和518片段進行亞克隆，進一步縮小功能片段，發(fā)現(xiàn)抗性菌株有兩個基因發(fā)生突變。兩基因分別為raxR2基因和conserved hypothetical protein(Chp)基因發(fā)生突變。其中raxR2基因有7個堿基發(fā)生突變，但未造成氨基酸序列變化；Chp基因發(fā)生一個堿基突變，引起了氨基酸變化(Val變成Gly)。
　　 3.水稻白葉枯病菌和條斑病菌鏈霉素抗性機理研究
　

6、　 通過室內(nèi)紫外誘變和藥劑馴服獲得了水稻條斑病菌和白葉枯病菌鏈霉素抗性突變體。這些突變體可以在含100μg/mL鏈霉素平板上生長，而敏感菌株在5μg/mL濃度下則不能生長。通過田間致病力測定，發(fā)現(xiàn)抗性菌株在水稻葉片上的致病力與敏感出發(fā)菌株無明顯差異。從水稻條斑病菌和白葉枯病菌野生敏感菌株及室內(nèi)誘導抗性菌株中分別擴增到編碼核糖體蛋白S12編碼基因(rpsL)全序列，序列分析表明rpsL基因中第43位或第88位氨基酸由賴氨酸(AAG)突變

7、為精氨酸(AGG)。rpsL基因全長375bp，編碼125個氨基酸。序列分析結(jié)果表明水稻條斑病菌與水稻白葉枯病菌rpsL基因同源性達97％，編碼氨基酸同源性達100％；與柑橘潰瘍病菌氨基酸同源性達98％，與大白菜軟腐病菌氨基酸同源性達99％。設(shè)計合成1對含有酶切位點(EcoRⅠ)的特異性引物，從抗藥性菌株UV-R-1(含rpsL基因43位點突變)和UV-R-3(含rpsL基因88位點突變)中擴增出含啟動區(qū)的rpsL基因，成功構(gòu)建了重組質(zhì)

8、粒pUFRRS和pUFRRX。功能驗證證明，質(zhì)粒pUFRRS和pUFRRX能夠互補敏感菌株的抗藥性功能，結(jié)合子RS1、RS2、RS3、PS1、PS2對鏈霉素敏感性測定結(jié)果證實rpsL基因序列發(fā)生點突變是水稻白葉枯病菌和條斑病菌對鏈霉素產(chǎn)生抗藥性的主要原因。同時轉(zhuǎn)化子的致病力與敏感出發(fā)菌株和抗藥突變體的致病力無明顯差異。
　　 4.水稻白葉枯病菌、條斑病菌、大白菜軟腐病菌以及柑橘潰瘍病菌抗藥基因rpsL的分子檢測
　　 通

9、過室內(nèi)藥劑馴化和紫外誘導，獲得大白菜軟腐病菌鏈霉素抗性突變體12個，柑橘潰瘍病菌突變體11個，番茄細菌性斑點病菌突變體12個。分別比較番茄細菌性斑點病菌、柑橘潰瘍病菌、大白菜軟腐病菌鏈霉素抗性突變體與他們的敏感親本菌株的序列，發(fā)現(xiàn)所有抗鏈霉素菌株的rpsL基因中第43位或第88位氨基酸均由賴氨酸(AAG)突變?yōu)榫彼?AGG)。由于rpsL基因43位點是MboⅡ的酶切位點，因此通過PCR-RFLP方法可以檢測出上述細菌rpsL基因43位