外源DNA導(dǎo)入花生方法的研究及抗葉斑病變異品系的鑒定.pdf

1、本研究采用花粉管通道法和原位轉(zhuǎn)化法對豐花1號、白沙1016、豐花3號和79266四個花生栽培品種進行了遺傳轉(zhuǎn)化，初步探討了兩種轉(zhuǎn)化方法對結(jié)實率和T<,1>代出苗率的影響；確定了大田葉片涂抹篩選抗PPT轉(zhuǎn)基因花生的技術(shù)方法。對危害花生的三種葉斑病的病原菌進行了分離鑒定，重點對花生褐斑病病原菌的培養(yǎng)特性和致病性進行了探討。對利用花粉管通道法將國槐DNA和野生花生A．glabraDNA導(dǎo)入79266和白沙1016獲得的7個抗葉斑病變異品系進行

2、了系統(tǒng)的田間抗病性鑒定、主要農(nóng)藝性狀考察、品質(zhì)性狀分析和DNA差異的SSR多態(tài)性分析。取得的主要研究結(jié)果如下： 1．花粉管通道法和原位轉(zhuǎn)化法進行花生基因轉(zhuǎn)化的研究試驗采用花粉管通道法和原位轉(zhuǎn)化法對花生四個品種進行目的基因?qū)?，發(fā)現(xiàn)兩種導(dǎo)入方法對當(dāng)代的結(jié)實率有較大影響，花粉管通道法當(dāng)代的結(jié)實率高于原位轉(zhuǎn)化法當(dāng)代的結(jié)實率；兩種導(dǎo)入方法對T<,1>代出苗率也有較大影響，花粉管通道法T<,1>代的出苗率明顯高于原位轉(zhuǎn)化法。大田葉片涂抹6

3、0mg/LPPT時，未轉(zhuǎn)化植株葉片褐化明顯，四個品種的PPT臨界濃度相同。篩選抗PPT轉(zhuǎn)基因花生的適宜PPT濃度確定為60mg/L。 2、花生褐斑病、黑斑病和網(wǎng)斑病病原菌的獲得試驗采用組織分離法，獲得了花生褐斑病、黑斑病和網(wǎng)斑病的病原菌。對花生褐斑病病原菌的培養(yǎng)特性和致病性的研究表明：該病菌生長的溫度范圍較廣，在5～35℃間均能生長，生長適宜溫度為15～30℃，最適為25℃：產(chǎn)孢適宜溫度為15～30℃，最適為25℃。近紫外照射對

4、褐斑病病菌的孢子萌發(fā)有較明顯的促進作用。采用離體葉片接種和大田整株接種鑒定所分離的病原菌的致病性，兩種接種方法均能使葉片和植株感病，但兩種鑒定方法感病葉片的病斑特點有差異。 3、國槐DNA及野生花生DNA導(dǎo)入花生所選育抗葉斑病變異品系的鑒定。 (1)變異品系葉斑病病情級數(shù)與受體的比較 對變異品系花生褐斑病的抗性鑒定表明：國槐DNA導(dǎo)入79266所獲得的5個變異品系中，品系3的褐斑病抗性最強，小區(qū)病級僅為2.72，

5、品系4的抗性次之，小區(qū)病級為2.82，兩品系較受體的小區(qū)病級3.30都極顯著降低，品系1、2和5的褐斑病小區(qū)病級分別3.16、3.00和3.25，與受體相比，小區(qū)病級降低，但均未達顯著水平。野生花生A．gLabrateDNA導(dǎo)入白沙1016所獲得的兩個變異品系對褐斑病的抗性鑒定發(fā)現(xiàn)，品系7的小區(qū)病級僅為2.91，品系6的小區(qū)病級為3.36，受體白沙1016的小區(qū)病級為4.15，兩個變異品系的小區(qū)病級較受體都極顯著降低。 對變異品

6、系花生網(wǎng)斑病的抗性鑒定表明：國槐DNA導(dǎo)入受體獲得的5個變異品系，品系2的網(wǎng)斑病抗性最強，小區(qū)病級僅為3.11，其次為品系3，小區(qū)病級為3.19，受體79266的小區(qū)病級高達4.56。品系1、4和5的小區(qū)病級分別為3.90、3.62和3.65，5個變異品系的網(wǎng)斑病小區(qū)病級較受體都極顯著降低。野生花生A．glabrate DNA導(dǎo)入白沙1016獲得的品系6和品系7的網(wǎng)斑病小區(qū)病級分別為4.10和3.68，受體白沙1016的小區(qū)病級為5.6

7、2，兩個變異品系的抗病性提高幅度較大，差異達到極顯著水平。 (2)變異品系葉斑病病程發(fā)展進度與受體的比較 79266的AUDPC值為205.33，變異品系1～5的AUDPC值分別為158.67、112．00、116．67、133.00和145.83，較受體79266極顯著降低；白沙1016的AUDPC值為240.33，變異品系6和7的AUDPC值分別為170.33和177.33，較受體極顯著降低，即變異品系的葉斑病病害嚴(yán)

8、重程度和發(fā)展速度都較受體極顯著降低。 (3)變異品系主要農(nóng)藝性狀與受體的比較 外源DNA導(dǎo)入花生后引起了農(nóng)藝性狀的較大變異，受體79266的主莖高為63cm，經(jīng)國槐DNA導(dǎo)入79266獲得的5個變異品系中，品系1的主莖高僅為39cm，較受體極顯著降低，品系4的主莖高為54，較受體顯著降低：受體79266的側(cè)枝長為68cm，品系1的側(cè)枝長僅為52cm，較受體極顯著降低；受體79266的單株果數(shù)為15個，品系1的單株果數(shù)高達

9、46個，較受體極顯著提高，品系2和品系3的單株果數(shù)分別為30和31個，較受體顯著提高；受體79266的百果重為271g，品系1、3和5的百果重的分別為133g、208g和237g，較受體極顯著降低，品系4的百果重為246g，較受體顯著降低：受體79266的單株果重為25.93g，品系2、3和4的單株果重分別為14.32g、21.99g、和12.32g，較受體極顯著降低，品系5的單株果重為22.71g，較受體顯著降低。受體白沙1016的百

10、果重和單株果重分別為74g和20.76g，經(jīng)野生花生A．glabrate DNA導(dǎo)入白沙1016獲得．的品系6的百果重為66g，顯著低于受體，品系7的百果重為89g，極顯著高于受體；品系6的單株果重為15.33g，極顯著低于受體。各品系對葉斑病的抗性與主要農(nóng)藝性狀無顯著相關(guān)。 (4)變異品系品質(zhì)性狀與受體的比較 受體79266的蛋白質(zhì)含量為24.69％，粗脂肪含量為54.1％，可溶性總糖含量為3.54％，0/L值為2.1

11、6。經(jīng)國槐DNA導(dǎo)入79266獲得的5個變異品系中，品系2和品系4的蛋白質(zhì)含量分別是26.53％和26.13％，極顯著高于受體，品系1和品系3的蛋白質(zhì)含量分別是23.75％和23.00％，顯著低于受體；品系2的粗脂肪含量為49.43％，極顯著低于受體，品系3的脂肪含量為52.03％，顯著低于受體：品系1的可溶性總糖含量為3.81％，顯著高于受體，品系2和品系3的總糖含量分別為4.25％和4.29％，極顯著高于受體，品系4的總糖含量為2.

12、86％，極顯著低于受體；品系2和品系4的0/L值分別為1.79和1.26，極顯著低于受體，品系3的0/L值為2. 38，極顯著高于受體。 受體白沙1016的蛋白質(zhì)含量為27.32％，粗脂肪含量為53.73％，可溶性總糖含量為3.82％，0/L值為1.23。經(jīng)野生花生A．glabrate DNA導(dǎo)入白沙1016獲得品系6的蛋白質(zhì)含量為24.82％，粗脂肪含量為51.13％，都極顯著低于受體，可溶性總糖含量為4.60％，極顯著高于受

13、體，0/L值為2.04，極顯著高于受體；品系7的可溶性總糖含量為5.24％，極顯著高于受體，0/L值為2.32，極顯著高于受體。 (5)變異品系與受體DNA差異的SSR多態(tài)性分析 采用40對引物進行SSR擴增，在品系1～7與受體間分別有19、20、18、19、20、17和15對引物擴增出條帶，其中多態(tài)性引物分別有6、7、5、6、4、4和3對。采用篩選的多態(tài)性引物在7個變異品系與受體間分別擴增出22、24、22、23、23