大白菜半胱氨酸脫巰基酶突變植株的構建.pdf

1、硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化氮和一氧化碳之后第三種氣體信號分子，在植物體的生長發(fā)育和抵御外界脅迫過程中發(fā)揮著重要的作用。近年來，環(huán)境污染日益嚴重，對大白菜的生長發(fā)育過程產生嚴重的抑制作用。半胱氨酸脫巰基酶(DES1和LCD)是產生H2S的關鍵酶，將DES1和LCD基因整合入大白菜基因組，有可能提高其抗逆性，同時為白菜育種提供新種質。另外，CRISPR/Cas9被認為是第三代基因組編輯技術，具有較高的基因編

2、輯效率，利用CRISPR/Cas9技術將白菜中半胱氨酸脫巰基酶基因功能敲除，可為研究H2S信號在大白菜中的生理功能提供理論基礎以及為后續(xù)研究提供突變體材料。
　　本實驗以大白菜(Brassica campestris L.ssp.pekinensi)自交系“矮青1號”為材料，在本課題組已有的培養(yǎng)轉化體系基礎上對種子的消毒時間、菌液侵染時間以及抗生素篩選壓進行優(yōu)化，獲得有效的轉化體系，同時構建了DES1、LCD過表達載體和LCD缺失

3、突變載體，并利用農桿菌介導的遺傳轉化法成功獲得了遺傳轉化植株，本文主要研究結果如下:
　　1.過表達載體的構建:用限制性內切酶NcoⅠ-HF和EcoRⅠ-HF雙酶切載體pET-28a-DES1和XF-246，BamHⅠ-HF和SalⅠ-HF雙酶切載體pET-28a-LCD和pCAM2300，將具有相同粘末端的酶切產物進行連接后轉化大腸桿菌DH5α，得到過表達載體XF-246-DES1和pCAM2300-LCD，通過酶切和PCR鑒定

4、證明重組載體構建成功，并成功轉化到農桿菌LBA4404。
　　2.缺失突變載體的構建:爭對大白菜LCD基因設計了20bp靶點，化學合成該序列，并將其克隆到中間線性載體AtU6-26-sgRNA-SK中，酶切和測序鑒定正確。然后用NheⅠ-HF和SpeⅠ-HF雙酶切重組載體AtU6-26-sgRNA-SK-LCD，得到sgRNA cassette片段，同時用SpeⅠ-HF單酶切載體pYAO，將基因片段與線性載體片段回收連接后轉化DH

5、5a，得到缺失突變載體pYAO-LCD，經酶切鑒定正確，并成功轉化了農桿菌LBA4404。
　　3.大白菜遺傳轉化體系的優(yōu)化:用0.1％的HgCl2對種子消毒6min，既能保持較高的萌發(fā)率又能防止內源菌的產生;用OD600為0.2～0.3的菌液侵染外植體5min，分別以7.5mg·L-1和5.0mg·L-1的潮霉素作為抗性芽和根的抗生素篩選濃度，轉化效率較高，過表達載體XF246-DES1轉化大白菜的轉化率為10％;過表達載體pC

6、AM2300-LCD的轉化率為8％;CRISPR/Cas9敲除突變載體pYAO-LCD的轉化率為13.3％。
　　4.轉基因植株的檢測:通過qRT-PCR檢測了陽性植株中轉化目的基因的表達量以及利用四通道自由基分析儀測定了轉基因植株中H2S含量，結果顯示:DES1和LCD過表達植株中DES1和LCD的表達量顯著提高，且H2S含量極顯著升高;LCD缺失突變植株(lcd)中，LCD靶點序列發(fā)生了堿基替換，說明CRISPR/Cas9基因