LPA對綿羊體外受精早期胚胎和囊胚接種細胞培養(yǎng)的影響.pdf

1、體外受精技術(shù)作為胚胎工程研究領(lǐng)域的一項關(guān)鍵技術(shù)，廣泛地應(yīng)用于家畜繁殖領(lǐng)域，為家畜遺傳保種等提供了技術(shù)保障。綿羊是我國重要的家畜之一，也是家畜體外受精最早研究的動物，但其體外受精效率卻明顯低于其他家畜。除此之外，干細胞在家畜領(lǐng)域具有非常大的潛在應(yīng)用價值。綿羊類干細胞的體外培養(yǎng)，不僅可以作為研究哺乳動物發(fā)育的體外模型，也可以用于治療和育種，應(yīng)用前景廣闊，但目前綿羊干細胞的研究仍處于起步階段。
　　溶血磷脂酸(LPA)是一種小分子甘油磷

2、脂，在多種動物細胞中具有生長因子和激素樣活性。LPA通過結(jié)合其耦聯(lián)G蛋白的各種受體，激活下游多條信號通路，產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)，如促進細胞增殖、分化、遷移、侵襲、黏附和形態(tài)發(fā)生等。有研究表明，LPA可促進卵母細胞成熟，提高胚胎發(fā)育率，對細胞增殖有促進作用。通過在體外受精及囊胚接種細胞培養(yǎng)過程中添加LPA，探究LPA對綿羊體外受精的促進機制以及囊胚接種細胞培養(yǎng)的影響，為家畜體外受精及囊胚接種細胞建系提供參考。
　　本研究首先探討LPA對綿

3、羊體外受精早期胚胎發(fā)育的影響。選取了兩種成熟液，成熟液1與成熟液2，與兩種SOF液進行組合，通過比較不同體系間的成熟率、卵裂率和囊胚率，最終找到最優(yōu)的體外受精的體系即成熟液1+SOF2。然后在綿羊卵母細胞體外成熟、體外受精和受精卵體外培養(yǎng)過程中添加不同濃度的LPA，統(tǒng)計不同LPA濃度對體外受精過程中成熟率、卵裂率及囊胚率的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)LPA濃度為0.1μ M、1μ M及10μM之間時，隨著LPA濃度的增加，綿羊卵母細胞體外成熟率、

4、卵裂率、囊胚率逐漸上升，且囊胚形態(tài)正常;但當(dāng)LPA濃度達到15μ M時，成熟率、卵裂率、囊胚率出現(xiàn)下降，并且囊胚形態(tài)發(fā)生異常，胚胎內(nèi)細胞團聚集不正常，囊胚內(nèi)部出現(xiàn)分區(qū)，不能發(fā)育成為優(yōu)質(zhì)的囊胚。為了檢測在不同濃度LPA的刺激下，LPARs及干性標(biāo)記基因OCT-4與CDX-2在早期胚胎中的表達量，通過實時定量PCR檢測了LPAR1、LPAR2、LPAR3、LPAR4、LPAR5、LPAR6、OCT-4與CDX-2在2細胞期、4細胞期、8細胞

5、期、桑葚胚期和囊胚期中的表達情況。結(jié)果顯示，在不同LPA濃度下，LPARs在早期胚胎各個時期均有表達，其中LPAR2的表達量明顯高于其他5種受體的表達量，LPAR4表達量僅低于LPAR2，LPAR1與LPAR3表達量較接近，LPAR5與LPAR6表達量較為接近，但LPAR1、LPAR3、LPAR5與LPAR6表達量極低。LPAR2與LPAR4表達量在2細胞時期到囊胚期呈現(xiàn)上升趨勢，且當(dāng)LPA濃度為0-10μM時，隨著LPA濃度的增加而增

6、加，而當(dāng)LPA濃度為15μM時，二者的表達量卻出現(xiàn)抑制。
　　為了探討LPA濃度對囊胚接種細胞培養(yǎng)的影響，在囊胚接種細胞培養(yǎng)體系中添加不同濃度的LPA，觀察不同體系下囊胚接種細胞的生長情況，通過免疫熒光染色與實時熒光定量PCR來檢測細胞中干細胞多能性標(biāo)志物OCT4及滋養(yǎng)層干細胞標(biāo)志基因CDX2的表達。選取GFF為飼養(yǎng)層，2i為基礎(chǔ)培養(yǎng)體系，與Wnt-3a、hLif、Forskolin及LPA組合形成8種培養(yǎng)體系。結(jié)果顯示只添加2i

7、培養(yǎng)液囊胚接種細胞生長緩慢，且出現(xiàn)分化現(xiàn)象;培養(yǎng)體系添加2i與Wnt-3a，貼壁囊胚長出扁平片狀結(jié)構(gòu)，單層細胞下有液體積聚成穹窿狀結(jié)構(gòu)，與滋養(yǎng)層干細胞相似，呈OCT4與CDX2陽性;體系為2i加hLif，貼壁囊胚細胞克隆較為致密，其形態(tài)類似于小鼠胚胎干細胞，成三維立體生長，OCT4呈陽性CDX2呈陰性。在2i與hLif培養(yǎng)體系中添加Forskolin，囊胚接種細胞呈扁平片狀生長，呈OCT4與CDX2陽性。取不同濃度LPA與2i、hLif

8、、Forskolin組合，發(fā)現(xiàn)隨著LPA濃度的增加，囊胚接種細胞呈扁平片狀生長，細胞克隆的細胞核和細胞輪廓清晰，片狀細胞克隆邊緣出現(xiàn)增厚，甚至出現(xiàn)類似于牛胚胎干細胞的穹窿狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)形成滋養(yǎng)層干細胞的趨勢。在OCT4與CDX2的免疫熒光染色中，熒光強度在一定程度上隨著LPA濃度的增加而增強。實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，OCT4與CDX2表達量隨LPA濃度的增大而增大，但過高濃度LPA卻會抑制OCT4與CDX2表達量。
　　綜合上述