五指山豬近交系矮小性分子遺傳基礎研究.pdf

1、五指山豬(Wuzhishang pig,WZSP)是我國著名珍稀豬種,是原產于海南島中南部山區(qū)的一個瀕臨滅絕的地方豬種,成年體重僅30-35kg,僅為正常豬種體重的15-30﹪,而且具有抗逆性強、性成熟早、肉質好、遺傳穩(wěn)定等特性,經近20年來的異地保種、實驗化近交繁育,目前己培育成近交系群體并已獲得Fis個體(近交系數(shù)高達0.979).由于其在解剖學、生理學特性、營養(yǎng)代謝等方面與人類極為相似,已在生物醫(yī)學領域中得到廣泛應用,己成為研究人

2、類疾病理想的動物模型,并列為我國異種器官移植、組織工程和"國家實驗用小型豬種質資源保存和開發(fā)中心"首選種豬.本研究以純種近交16代WZSP為實驗材料,對其內分泌生長軸相關基因進行了一系列分子遺傳學基礎研究,旨在探討WZSP近交系矮小的分子機理,并為其成為理想的實驗動物模型提供科學的理論依據(jù). 1)采用Elisa方法檢測了三月齡的大白豬和WZSP近交系的血清GH和IGF-I含量,比較發(fā)現(xiàn):WZSP近交系血清GH濃度略低于大白豬,但

3、二者之間差異不顯著(P>0.05);而WZSP近交系血清IGF-I濃度顯著低于大白豬(P<0.05),其中WZSP近交系母豬血清IGF-I濃度顯著低于大白豬母豬(P<0.05). 2)克隆得到WZSP近交系GH全長cDNA(己登錄GenBank,登錄號為DQ415717),預測其編碼蛋白包括216個氨基酸,分子量為24.4Kda,等電點為7.175.WZSP近交系GH基因編碼區(qū)推導蛋白的氨基酸序列與普通豬GH基因(GenBank

4、登錄號:X53325)推導蛋白的氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn):9號位置WZSP近交系發(fā)生氨基酸替換,纈氨酸替換丙氨酸(A-V),22號位置WZSP近交系發(fā)生氨基酸替換,谷氨酰胺替換精氨酸(R-0).但這兩處氨基酸替換均位于信號肽編碼區(qū),對GH的成熟肽沒有影響. 3)克隆得到WZSP近交系GHR.基因,其編碼區(qū)長1917bp(已登錄GenBank,登錄號為DQ422962),該編碼區(qū)編碼一個擁有638個氨基酸的蛋白質,其分子量為71.1

5、Kda,等電點為4.509,是一個偏酸性蛋白質.WZSP近交系GHR基因編碼區(qū)推導蛋白的氨基酸序列與普通豬GHR基因(GenBank登錄號:NM214254.)推導蛋白的氨基酸序列進行比對發(fā)現(xiàn)WZSP近交系GHR基因胞內結構域存在五處氨基酸替換,可能會影響到WZSP近交系GHR下游的信號轉導;而比對大白豬的GHR基因編碼區(qū)推導蛋白氨基酸序列與WZSP近交系GHR發(fā)現(xiàn):GHR胞外結構域和胞內結構域均存在兩處氨基酸替換,與己發(fā)現(xiàn)的人GHR基

6、因突變不盡相同,但是其中165號位置的氨基酸替換位于GHR的FN3保守結構域中,推測該氨基酸替換可能對GHR的結構和功能產生重要的影響. 4)克隆得到WZSP近交系IGF-I基因大小為525bp,包含編碼區(qū)393bp.該編碼區(qū)僅發(fā)現(xiàn)一個同義突變,未引起所編碼氨基酸的變化.該基因的編碼區(qū)編碼一個130個氨基酸的IGF-I前體蛋白,分子量為14.4Kda,等電點為9.144,是一個偏堿性蛋白. 5)構建了WZSP近交系GH和

7、GHR基因原核表達載體,并進行誘導表達,WZSP近交系GH基因得到正確表達,在目的分子量處出現(xiàn)特異性條帶,經軟件掃描,其含量約占菌液總蛋白的20﹪:WZSP近交系GHR.基因并沒有發(fā)現(xiàn)特異性條帶,推測可能是由于大腸桿菌的密碼子偏愛造成了該基因在原核生物中表達困難.6)構建了WZSP近交系GH基因、大白豬和WZSP近交系GHR基因真核表達載體,并轉染豬腎細胞PK-15 進行表達,采用相對定量RT-PCR方法檢測JAK2基因表達,結果發(fā)現(xiàn):