草魚呼腸孤病毒拮抗宿主細(xì)胞RNA干擾信號通路的機(jī)制研究.pdf

1、草魚呼腸孤病毒隸屬于水生呼腸孤病毒屬，是引起草魚出血病的主要病原。該病毒基因組由11條雙鏈RNA組成，共編碼7個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白和5個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白。GCRV導(dǎo)致宿主細(xì)胞融合、凋亡、應(yīng)急顆粒產(chǎn)生等病理變化。GCRV的雙鏈RNA能夠在病毒正常復(fù)制周期避免結(jié)合Dicer并逃逸宿主RNAi抗病毒作用通路。
　　本文利用RACE技術(shù)、Real-time PCR、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等方法對以下三個(gè)方面進(jìn)行研究：
　　1.草魚Dicer基因的克隆與表達(dá)

2、>　　在RNAi介導(dǎo)的沉默機(jī)制中, Dicer發(fā)揮著重要的作用。本研究通過同源克隆方法和RACE技術(shù)獲得草魚Dicer cDNA序列,其開放閱讀框?yàn)?646bp，編碼1881個(gè)氨基酸。草魚 Dicer含有其他生物 Dicer的所有結(jié)構(gòu)域。在草魚腦、鰓、頭腎、肝臟、脾臟、心臟、肌肉、和腸8個(gè)不同組織中, Dicer基因均有分布。GCRV感染CIK細(xì)胞條件下，Dicer表達(dá)在24h時(shí)上調(diào)，與對照組顯著性差異。同樣在Poly(I:C)刺激CI

3、K細(xì)胞條件下，Dicer表達(dá)在2h時(shí)上調(diào)，與對照組顯著性差異。不同組織的時(shí)序表達(dá)研究結(jié)果顯示,在肝臟中,草魚 Dicer在病毒感染12h時(shí)表達(dá)量開始上調(diào),且與對照組有顯著性差異,72h時(shí)恢復(fù)到正常水平;而在脾臟組織的表達(dá)模式和肝臟的表達(dá)模式相似。同時(shí)，進(jìn)行草魚Dicer的原核表達(dá)，蛋白純化和多克隆抗體的制備。
　　2.鑒定拮抗宿主RNAi的病毒蛋白
　　將病毒的12個(gè)基因構(gòu)建到pEGFP-N1真核表達(dá)載體，并表達(dá)EGFP融合

4、蛋白。將重組質(zhì)粒和GFP(熒光蛋白基因)特異性的shRNA共轉(zhuǎn)染到CIK細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后,用熒光顯微鏡觀察 GFP蛋白的熒光強(qiáng)度，并實(shí)時(shí)定量 PCR(qRT-PCR)檢測 GFP mRNA的表達(dá)量,確定NS31蛋白是病毒編碼抑制RNAi的蛋白。
　　本研究成功克隆草魚 Dicer基因、并對 GCRV和Poly(I:C)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這為草魚的抗病免疫應(yīng)答機(jī)理提供了新思路。初步鑒定NS31是抑制宿主RNAi的病毒蛋白，這加深了對病毒復(fù)