纖維素酶水解殼聚糖的特性及機理研究.pdf

1、國內(nèi)外報道表明，纖維素酶能非專一性地水解殼聚糖，由于價格低廉，目前已替代甲殼素酶和殼聚糖酶廣泛應(yīng)用于甲殼聚低聚糖的生產(chǎn)。但其水解殼聚糖的作用是由于纖維素酶中的雜質(zhì)還是纖維素酶本身引起、纖維素酶水解殼聚糖的作用方式和水解機理等方面仍不清楚。因此有必要深入探討纖維素酶對殼聚糖水解的特性和規(guī)律，從而了解酶解機理。本論文的研究，對于進一步闡明非專一性酶水解殼聚糖的作用機理具有重要的學術(shù)意義，同時對于酶法生產(chǎn)甲殼低聚糖具有重要的應(yīng)用價值。

2、 本論文首先對四種商品纖維素酶水解殼聚糖的活性進行比較，從中篩選出一種水解殼聚糖活性最高的綠色木霉產(chǎn)纖維素酶。其水解殼聚糖的最適作用溫度為60℃、最適作用pH為5.2；水解羧甲基纖維素的最適作用溫度為55℃、最適作用pH為4.2。在纖維素酶水解殼聚糖的最適條件下，運用粘度法、TCL法及還原糖法等對纖維素酶水解殼聚糖的特性進行研究，結(jié)果表明殼聚糖經(jīng)纖維素酶水解10min，溶液粘度下降54.5％；殼聚糖的水解反應(yīng)速率與底物的脫乙酰度及底物的

3、粘均分子量之間關(guān)系不顯著；不同脫乙酰度的殼聚糖的水解產(chǎn)物基本一致，初期以甲殼四糖、甲殼五糖、甲殼六糖等為主，隨著時間的延長，有少量甲殼二糖、單糖產(chǎn)生，表明纖維素酶中含有內(nèi)切酶、外切酶和β-葡萄糖苷酶等多種酶。 采用DEAE-SepharoseCL-6B陰離子交換層析、PhenylSepharoseCL-4B疏水層析、SephadexG-75凝膠層析等方法從纖維素酶中分離純化得到一種既具有殼聚糖酶活性又具有纖維素酶活性的酶組分CC

4、BE，采用RP-HPLC、SDS-PAGE經(jīng)銀染、IEF等工作原理不同的三種方法鑒定其為一種純酶組份。經(jīng)測定CCBE相對分子質(zhì)量為66,000，等電點pI接近4.45。 運用還原糖含量的測定方法，對CCBE的水解殼聚糖的酶學性質(zhì)進行研究，結(jié)果表明，CCBE水解脫乙酰度90％殼聚糖的最適作用溫度為60℃、最適pH為5.2；Km=0.746mgGlcN/mL，Vmax=0.0268mg/mL·min；CCBE的水解殼聚糖活性在30℃

5、～40℃之間非常穩(wěn)定，50℃作用60min相對殘余酶活略有下降，60℃作用30min其相對殘余酶活下降為60％，70℃和80℃作用30min，相對殘余酶活急劇下降；其殼聚糖酶活性在pH4.0～7.8之間較為穩(wěn)定。對CCBE水解羧甲基纖維素的酶學性質(zhì)研究表明，其最適作用溫度為55℃、最適pH為4.2，Km=4.078mgGlu/mL，Vmx=0.127mg葡萄糖/mL·min；其羧甲基纖維素酶活性在30℃～50℃之間非常穩(wěn)定，60℃作用3

6、0min其相對殘余酶活保留84％。70℃和80℃作用30min，相對殘余酶活急劇下降，其纖維素酶活性在pH4.0～6.0之間較為穩(wěn)定，表明CCBE水解殼聚糖和纖維素兩種不同底物時酶學性質(zhì)有較大差異。 金屬離子Mn2+、Mg2+對酶的兩種活性均有較強的促進作用，重金屬對兩種酶活性強烈的抑制作用，常見的金屬離子(堿金屬離子和堿土金屬離子)對CCBE的殼聚糖酶活和CMCase酶活兩種酶活性沒有明顯的激活和抑制作用，表明兩種酶活性不依賴

7、于金屬離子。 采用已知結(jié)構(gòu)的甲殼低聚糖為底物，運用TLC、HPLC及過程分析法對CCBE水解甲殼低聚糖的特性進行研究，結(jié)果表明，CCBE不能水解GlcNAc-GlcNAc之間的糖苷鍵，也不具有轉(zhuǎn)糖苷的特性，能以β-葡萄糖苷酶的方式作用于甲殼低聚糖，從甲殼聚低聚糖的非還原端依次切下單個糖環(huán)。采用還原端基測定法對CCBE水解殼聚糖產(chǎn)物的還原端基，水解產(chǎn)物中存在GlcN、GlcNAc兩種還原性端基，提示CCBE能從非還原端水解GlcN

8、-GlcNAc、GlcNAc-GlcN、GlcN-GlcN之間的糖苷鍵；CCBE水解CMC、殼聚糖混合底物動力學研究表明，CCBE采用同一活性中心催化兩種不同底物水解。 采用NAI、DTT、NBS、pHMB、DTNB、CHD、DEP、EDC、Ch-T、PMSF等化學修飾劑對CCBE的殼聚糖酶活性和羧甲基纖維素酶活性中心氨基酸組成進行修飾研究，結(jié)果表明：參與其殼聚糖酶活性中心的氨基酸殘基主要有1分子色氨酸、2分子絲氨酸/蘇氨酸、1