組織型激肽釋放酶通過表皮生長因子受體促進(jìn)神經(jīng)突生長的機(jī)制研究.pdf

1、激肽釋放酶—激肽系統(tǒng)是體內(nèi)重要的調(diào)節(jié)系統(tǒng)，參與了腦缺血損傷的病理生理過程。組織型激肽釋放酶(tissue kallikrein，TK)是激肽釋放酶—激肽系統(tǒng)的核心成員，可以從抑制炎癥反應(yīng)、對抗氧化應(yīng)激、減少細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管新生、誘導(dǎo)神經(jīng)再生等環(huán)節(jié)發(fā)揮腦缺血后神經(jīng)血管的保護(hù)和修復(fù)作用。我們課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)，TK可以促進(jìn)神經(jīng)元生長，可能對腦血管病后遺癥的神經(jīng)修復(fù)治療具有一定幫助。因此，本研究以人類SH-SY5Y細(xì)胞系和小鼠大腦皮層原代

2、神經(jīng)元為離體細(xì)胞模型，將表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)和flotillin-2等蛋白作為研究靶點，對TK促進(jìn)神經(jīng)突生長的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行探索。
　　第一章 組織型激肽釋放酶通過表皮生長因子受體激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2
　　目的:探討TK激活EGFR、MAPK的信

3、號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:本研究以人類SH-SY5Y細(xì)胞系作為體外神經(jīng)元模型，采用western blot檢測TK誘導(dǎo)的EGFR、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2(extracellular regulated proteinkinase1/2，ERK1/2)、p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated proteinkinase，p38)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，J

4、NK)等蛋白的磷酸化水平;采用免疫熒光法檢測TK干預(yù)后EGFR的細(xì)胞內(nèi)定位;本實驗應(yīng)用RNA干擾技術(shù)下調(diào)細(xì)胞EGFR后，對TK誘導(dǎo)的ERK1/2、p38、JNK等MAPK蛋白的磷酸化水平進(jìn)行檢測;并應(yīng)用抑制劑PD98059阻斷ERK1/2后，對TK誘導(dǎo)的EGFR磷酸化水平進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果:①較低濃度TK(0.0625μM、0.125μM)干預(yù)并不能提高EGFR的磷酸化水平，而較高濃度TK（0.25μM、0.5μM和1.0μM）

5、則可以顯著激活EGFR的磷酸化;②TK激活后，EGFR大量聚集在細(xì)胞核周圍，發(fā)生了定位改變;③TK可以激活ERK1/2、p38磷酸化，兩者分別在TK干預(yù)的5min和15min達(dá)到高峰，而JNK磷酸化水平并無顯著變化;④下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞EGFR的蛋白水平后，TK誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化水平顯著降低，而p38磷酸化水平無顯著變化;⑤在PD98059預(yù)處理有效阻斷TK誘導(dǎo)ERK1/2磷酸化的同時，TK誘導(dǎo)的EGFR磷酸化水平并無顯著變化

6、。
　　結(jié)論:TK可以激活SH-SY5Y細(xì)胞的EGFR磷酸化，并促進(jìn)EGFR向細(xì)胞核周圍發(fā)生轉(zhuǎn)位;TK可以激活ERK1/2、p38等信號蛋白磷酸化;TK通過EGFR調(diào)節(jié)下游的ERK1/2通路。
　　第二章 組織型激肽釋放酶通過notillin-2激活表皮生長因子受體通路
　　目的:探討TK激活flotillin-2、EGFR、ERK1/2的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　方法:本研究以人類SH-SY5Y細(xì)胞系作為體外神經(jīng)元模

7、型，應(yīng)用相應(yīng)抑制劑或RNA干擾技術(shù)分別阻斷緩激肽B1受體、B2受體、flotillin-2、EGFR、ERK1/2等蛋白后，采用western blot檢測TK干預(yù)后EGFR和ERK1/2磷酸化水平的變化;采用免疫共沉淀檢測TK激活狀態(tài)下flotillin-2和EGFR蛋白的結(jié)合關(guān)系;采用免疫熒光法檢測TK干預(yù)后flotillin-2和EGFR在細(xì)胞內(nèi)的定位。
　　結(jié)果:①TK可以顯著提高SH-SY5Y細(xì)胞EGFR和ERK1/2的

8、磷酸化水平;②阻斷緩激肽B1受體、B2受體，TK誘導(dǎo)的EGFR、ERK1/2磷酸化水平無顯著改變;③阻斷flotillin-2，TK誘導(dǎo)的EGFR、ERK1/2磷酸化水平顯著降低;④阻斷EGFR，TK誘導(dǎo)的ERK1/2磷酸化水平顯著降低;⑤阻斷ERK1/2，TK誘導(dǎo)的EGFR磷酸化水平無顯著改變;⑥使用flotillin-2抗體進(jìn)行的免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn)，TK激活后EGFR和磷酸化EGFR均呈現(xiàn)兩條蛋白條帶;⑦免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，正常狀態(tài)下

9、，flotillin-2和EGFR在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)內(nèi)均有表達(dá)，當(dāng)TK干預(yù)后，flotillin-2和EGFR大量聚集在細(xì)胞核周圍，并且兩者共定位。
　　結(jié)論:TK不依賴緩激肽受體激活flotillin-2—EGFR—ERK1/2信號通路;flotillin-2和EGFR相互結(jié)合形成復(fù)合物，在TK的作用下，flotillin-2和EGFR的結(jié)合構(gòu)象發(fā)生了改變;TK可以促進(jìn)flotillin-2—EGFR復(fù)合物向細(xì)胞核周圍轉(zhuǎn)位。

10、>　　第三章 組織型激肽釋放酶通過flotillin-2、表皮生長因子受體、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2介導(dǎo)神經(jīng)突生長
　　目的:探討TK通過flotillin-2、EGFR、ERK1/2等蛋白介導(dǎo)神經(jīng)突生長的機(jī)制。
　　方法:本研究以小鼠大腦皮層原代神經(jīng)元為體外細(xì)胞模型，應(yīng)用相應(yīng)抑制劑或RNA干擾技術(shù)分別阻斷緩激肽B1受體、B2受體、flotillin-2、EGFR、ERK1/2等蛋白后給予TK干預(yù)，采用免疫熒光染色結(jié)合Ima

11、ge J軟件對神經(jīng)突的數(shù)量和平均突起長度進(jìn)行檢測。
　　結(jié)果:①TK可以顯著提高神經(jīng)突的數(shù)量和平均突起長度;②阻斷緩激肽B1受體、B2受體，神經(jīng)突的數(shù)量和平均突起長度與TK組相比無顯著統(tǒng)計學(xué)差異;③阻斷flotillin-2后給予TK干預(yù)，神經(jīng)突的生長趨勢受到顯著抑制;④阻斷EGFR后，TK誘導(dǎo)的神經(jīng)突的生長趨勢被顯著抑制;⑤阻斷ERK1/2后給予TK干預(yù)，神經(jīng)突的數(shù)量和平均突起長度與TK組相比顯著降低。
　　結(jié)論:TK不依