2-氨基壬烷-6-甲氧基四氫萘鹽酸鹽(10b)體外抗真菌活性及作用機制研究.pdf

1、白念珠菌感染由于在艾滋病患者，器官移植患者以及其他免疫缺陷患者中具有高發(fā)病率和高死亡率的特點，已成為一個嚴重的醫(yī)學(xué)問題。盡管抗真菌藥物品種不斷增加，但仍然滿足不了病情復(fù)雜患者對控制感染越來越高的需求。本課題的研究目的是探討具有新型化學(xué)結(jié)構(gòu)的抗真菌化合物2-氨基壬烷-6-甲氧基四氫萘鹽酸鹽（10b）的體外抗真菌活性和作用機制，為降低真菌相關(guān)感染提供有用的信息和策略。微量液基稀釋法結(jié)果顯示10b對氟康唑敏感白念珠菌以及氟康唑耐藥白念珠菌均有

2、良好的抗真菌活性，MIC80值的范圍從0.031μg/ml到8μg/ml，活性強與氟康唑或酮康唑相當(dāng)或者更強；對氟康唑耐藥白念珠菌的抗真菌活性強大，其作用普遍強于酮康唑，尤其對氟康唑高度耐藥的實驗室誘導(dǎo)白念珠菌SC5314R（對氟康唑和伊曲康唑都高度耐藥，MIC80值均為256μg/ml）作用更加顯著，MIC80值為0.125μg/ml。瓊脂平皿紙片擴散實驗進一步證實10b對氟康唑耐藥白念珠菌的抗真菌活性強于氟康唑和酮康唑并且表現(xiàn)出一定

3、的殺菌作用。生長曲線實驗，半數(shù)抑菌濃度（IC50）測定以及最低殺菌濃度（MFC）測定等多種實驗手段和方法均證實10b具有強大的體外抗真菌活性。結(jié)晶紫染色實驗以及XTT還原分析實驗考察了10b對白念珠菌生物被膜的影響，結(jié)果顯示10b對白念珠菌生物被膜的形成以及成熟（48 h）白念珠菌生物被膜細胞代謝活性均有強大的抑制作用，并且抑制能力強于法尼醇。激光共聚焦顯微鏡觀察也進一步證實了10b強大的抑制白念珠菌生物被膜的作用：正常白念珠菌生物被膜

4、表現(xiàn)為主要由假菌絲和真菌絲組成的典型三維空間結(jié)構(gòu)；當(dāng)白念珠菌細胞在0 h與10 gM法尼醇共孵育48 h后，被膜的形成沒有受到抑制，仍然主要由真菌絲和假菌絲組成；與0.1μM的10b共孵育48 h后，盡管真菌絲和假菌絲仍然能夠觀察到，但被膜典型的三維空間結(jié)構(gòu)（相互纏繞的絲狀結(jié)構(gòu)和芽生孢子基底層）受到了破壞，被膜主要由酵母態(tài)細胞組成；當(dāng)lob的濃度增加10倍（1μM），粘附細胞從酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變被徹底抑制，導(dǎo)致了被膜的消失或者僅能生成

5、少量的全部由酵母態(tài)細胞組成的被膜。為了探討10b對白念珠菌的作用機制，我們首先采用薄層色譜分析（TLC）和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）分析考察10b在麥角甾醇生物合成通路上的作用靶點，通過透射電鏡觀察10b處理后對白念珠菌超微結(jié)構(gòu)的影響，然后采用cDNA芯片分析和realtimeRT-PCR分析從分子水平上考察10b處理酵母態(tài)白念珠菌以及被膜態(tài)白念珠菌基因表達譜的變化，最后采用MTS/PMS還原分析法評價了10b的體外細胞毒性。TL

6、C分析結(jié)果顯示10b處理后的薄層色譜圖上羊毛甾醇及其類似物的斑點與酮康唑處理后完全不同，前者斑點直徑明顯變小顏色變淡，甚至觀察不到而后者與空白對照相比斑點直徑顯著增加，顏色變深，這說明10b可能抑制了麥角甾醇生物合成通路上羊毛甾醇C-14去甲基酶之外的其他酶，導(dǎo)致羊毛甾醇向其他中間甾醇的轉(zhuǎn)化。GC/MS分析結(jié)果顯示10b處理組在氣相色譜圖上出現(xiàn)了與酮康唑處理組完全不同的色譜峰，前者所產(chǎn)生的甾醇成分與erg24菌株所產(chǎn)生的甾醇成分完全相同

7、，均以ergosta-8，14-dienol（ignosterol）作為主要甾醇同時伴隨大量ergosta-8，14，22-trienol的產(chǎn)生而后者則以24-methylene-lanost-8-en-3-ol作為主要甾醇。因此，10b在麥角甾醇生物合成通路上的真正作用靶點可能是ERG24基因編碼的甾醇C-14還原酶而不是ERG11基因編碼的羊毛甾醇C-14去甲基酶。為了證實上述觀點，我們比較了10b和甾醇C-14還原酶抑制劑丁苯嗎啉

8、（Fm）處理野生型白念珠菌（BWP17）以及erg24菌株（NJ51-2）所產(chǎn)生的甾醇成分種類及含量變化情況。雖然10b與嗎啉類都屬于甾醇C-14還原酶抑制劑，但兩者在麥角甾醇生物合成通路上的作用機制仍然存在差異。嗎啉類除抑制甾醇C-14還原酶外，還抑制由ERG2基因編碼的甾醇C-8異構(gòu)酶，因此丁苯嗎啉處理的野生型白念珠菌（BWP17）除以ergosta-8，14-dienol（ignosterol）作為主要甾醇外，還出現(xiàn)ergosta

9、-8-en-3-ol的堆積。由于甾醇C-8異構(gòu)酶位于甾醇C-14還原酶下游，因此丁苯嗎啉處理的erg24菌株（NJ51-2）所產(chǎn)生的甾醇種類及比例均與未處理的erg24菌株完全相同。10b處理的erg24菌株（NJ51-2）所產(chǎn)生的甾醇成分與未處理的erg24菌株（NJ51-2）所產(chǎn)生的甾醇成分完全相同，但兩者ergosta-8，14，22-trienol與ignosterol的比例卻不同。10b處理組所產(chǎn)生的ergosta-8，14，

10、22-trienol量明顯高于未處理組，這表明10b在麥角甾醇合成通路上除抑制甾醇C-14還原酶活性外，可能還存在另外一個靶點，并且這個靶點應(yīng)該位于甾醇C-14還原酶的上游。通過ergosta-8，14，22-trienol與ignosterol比例變化規(guī)律，我們推測它可能是與甾醇C-5去飽和酶相關(guān)的一個酶。另外，我們發(fā)現(xiàn)ignosterol的量隨著10b劑量的增加而增加，這表明10b在低濃度時甾醇C-5去飽和酶相關(guān)酶是主要的作用靶點；

11、隨著10b劑量增加，10b與甾醇C-14還原酶的結(jié)和力增強，最終使甾醇C-14還原酶成為占主導(dǎo)作用的靶點。盡管ERG24基因編碼的C-14還原酶是釀酒酵母有氧生長所必須的，但白念珠菌erg24突變體卻能夠在正常有氧條件下在標準限定滋養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。電鏡觀察結(jié)果也顯示10b處理后細胞膜結(jié)構(gòu)完整，光滑，邊界清晰，無胞內(nèi)物質(zhì)外流進入胞膜和胞壁之間。這表明10b雖然能夠抑制麥角甾醇生物合成通路上的甾醇C-14還原酶和甾醇C-5去飽和酶相關(guān)酶的活

12、性，導(dǎo)致麥角甾醇含量急劇降低，但由于中間甾醇的替代作用并不能破壞細胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，也不能完全抑制白念珠菌細胞的生長。因此，除了抑制麥角甾醇合成通路上的作用靶點之外，10b強大的抗白念珠菌活性必然還存在更為重要的作用機制。酵母態(tài)白念珠菌芯片分析和Real-timeRT-PCR分析結(jié)果顯示10b處理后，能量代謝相關(guān)基因，包括糖酵解相關(guān)基因（PFK1，CDC19和IHXK2），生醇發(fā)酵相關(guān)基因（PDC11，ALD5和ADH1）以及線粒體呼吸

13、鏈復(fù)合物相關(guān)基因（CBP3，COR1和QCR8）的表達水平顯著降低。實時熒光定量分析結(jié)果顯示10b處理白念珠菌后能夠顯著增加內(nèi)源性活性氧（ROS）的產(chǎn)生，并且能力強于咪康唑。線粒體功能分析結(jié)果表明10b處理后能夠降低線粒體膜電位（△ψm），泛醌-細胞色素C還原酶（復(fù)合物Ⅲ）活性以及細胞內(nèi)ATP的含量。另外，加入抗氧化劑抗壞血酸（ascorbic acid，AA）能顯著降低10b的抗真菌活性。這說明線粒體有氧呼吸鏈的轉(zhuǎn)換與內(nèi)源性ROS產(chǎn)生

14、的增加可能在10b抑制酵母態(tài)白念珠菌活性過程中起了重要作用。被膜態(tài)白念珠菌芯片分析和Real-time RT-PCR分析結(jié)果顯示10b處理后菌絲特異性基因ECE1表達急劇降低，編碼轉(zhuǎn)錄抑制因子Nrglp的基因NRG1表達水平顯著增加，這與10b抑制白念珠菌被膜形成的作用直接相關(guān)。另外，10b處理后還能引起能量代謝相關(guān)基因表達降低，包括糖酵解相關(guān)基因（HXK2和PFK1），生醇發(fā)酵相關(guān)基因（ADH1）以及內(nèi)源性ROS清除相關(guān)基因（SOD5

15、）表達水平顯著降低。功能分析結(jié)果顯示加入抗壞血酸能顯著降低10b對成熟白念珠菌生物被膜細胞代謝活性的抑制效率。上述結(jié)果表明10b對白念珠菌被膜形成的抑制作用可能主要依賴于改變被膜形成相關(guān)基因的表達，阻斷白念珠菌從酵母態(tài)向菌絲態(tài)的轉(zhuǎn)變，最終破壞了白念珠菌生物被膜的形成；線粒體有氧呼吸鏈的轉(zhuǎn)換與內(nèi)源性ROS產(chǎn)生的增加可能是10b降低成熟白念珠菌生物被膜細胞代謝活性的重要作用機制。體外細胞毒試驗結(jié)果表明：雖然10b劑量依賴性地抑制小鼠胚胎成纖