氨基酸添加對(duì)巴氏新小綏螨抗逆性的影響及其耐溫機(jī)理研究.pdf

1、巴氏新小綏螨Neoseiulus barkeri（Hughes）隸屬于植綏螨科Phytoseiidae新小綏螨屬Neoseiulus。巴氏新小綏螨是諸多吸汁性農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)的重要捕食性天敵，在農(nóng)林作物生物防治應(yīng)用方面，具有較廣的應(yīng)用前景和極其重要的應(yīng)用價(jià)值。前期研究證實(shí)在基礎(chǔ)飼料中添加氨基酸對(duì)腐食酪螨（替代獵物）和巴氏新小綏螨發(fā)育進(jìn)度、繁殖力、抗逆性、捕食功能等均有影響。鑒于此，本論文研究了亮氨酸、組氨酸2種氨基酸添加對(duì)巴氏新小綏螨的抗逆性及

2、捕食功能的影響，進(jìn)一步構(gòu)建了巴氏新小綏螨的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序文庫(kù)，并進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，對(duì)未添加與添加亮氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨間顯差異表達(dá)基因進(jìn)行了分析，最后對(duì)巴氏新小綏螨體內(nèi)3個(gè)熱激蛋白基因(Heat shock proteins，Hsps)進(jìn)行序列分析，并對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)模式進(jìn)行了研究。本研究結(jié)果對(duì)巴氏新小綏螨規(guī)模化、高效人工繁殖及提高其田間適應(yīng)性及防治效果有一定的指導(dǎo)意義，也可為了解Hsps在巴氏新小綏螨抗高溫逆境脅迫中的分子機(jī)制，為天敵的分子

3、改造提供理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)論如下:
　　1.氨基酸營(yíng)養(yǎng)添加能延長(zhǎng)巴氏新小綏螨的耐饑時(shí)間、提高巴氏新小綏螨的耐高溫能力以及捕食能力。在25℃飼養(yǎng)環(huán)境中，巴氏新小綏螨雌成螨喂養(yǎng)腐食酪螨的條件下，其群體存活率為50％時(shí)，添加亮氨酸的飼養(yǎng)組耐饑時(shí)間最長(zhǎng)，添加組氨酸的飼養(yǎng)組次之，未添加氨基酸的對(duì)照組耐饑時(shí)間最短，說(shuō)明添加氨基酸能延長(zhǎng)巴氏新小綏螨的耐饑時(shí)間;在40℃高溫下處理10h，經(jīng)亮氨酸和組氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨的存活率相比未添加氨基酸

4、對(duì)照組分別提高了56.00％和26.00％，說(shuō)明添加氨基酸能夠提高巴氏新小綏螨的耐高溫能力;添加氨基酸飼養(yǎng)后的巴氏新小綏螨的捕食能力和最大日捕食量都有一定的變化，其中相比于未經(jīng)氨基酸添加飼養(yǎng)的對(duì)照組，亮氨酸、組氨酸添加飼養(yǎng)后的巴氏新小綏螨的捕食能力有所提高，亮氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨捕食能力相對(duì)提高了17.08％，組氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨的捕食能力相對(duì)提高了31.82％。添加氨基酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨對(duì)腐食酪螨的捕食功能反應(yīng)曲線均為典型的無(wú)

5、脊椎動(dòng)物凸型曲線，即HollingⅡ型。
　　2.利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)未添加氨基酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨與添加亮氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨分別進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，使用Trinity軟件，將測(cè)序結(jié)果reads進(jìn)行無(wú)參測(cè)序數(shù)據(jù)拼接，拼接獲得巴氏新小綏螨的轉(zhuǎn)錄組Unigene，并對(duì)Unigene進(jìn)行功能注釋和GO、KEGG等蛋白質(zhì)功能分類(lèi)和代謝途徑分析。結(jié)果表明:未添加氨基酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨轉(zhuǎn)錄組共獲得52817486對(duì)raw data read

6、s共7.92G的測(cè)序總量。Trinity拼接結(jié)果獲得23893個(gè)基因，86422個(gè)轉(zhuǎn)錄本，將拼接獲得23893個(gè)gene使用BLAST方法進(jìn)行基因功能注釋后，其中有7260個(gè)注釋到Swiss-Prot庫(kù)，13386個(gè)注釋到NR庫(kù)，7567個(gè)注釋到Pfam庫(kù)，6078個(gè)注釋到KEGG庫(kù)，7420注釋到KOG庫(kù)，6604注釋到GO庫(kù)。添加亮氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨轉(zhuǎn)錄組共獲得64516490對(duì)raw datareads共9.68G的測(cè)序總量。

7、Trinity拼接結(jié)果獲得34480個(gè)基因，57021個(gè)轉(zhuǎn)錄本，將拼接獲得34480個(gè)gene使用BLAST方法進(jìn)行基因功能注釋后，其中有10509個(gè)注釋到Swiss-Prot庫(kù)，18556個(gè)注釋到NR庫(kù)，11230個(gè)注釋到Pfam庫(kù)，8499個(gè)注釋到KEGG庫(kù)，10735注釋到KOG庫(kù)，9664注釋到GO庫(kù)。
　　未添加氨基酸飼養(yǎng)與添加亮氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨相比，顯著性差異表達(dá)的基因共有1291個(gè)，其中上調(diào)顯著性差異表達(dá)的基因

8、有376個(gè)，例如囊泡相關(guān)膜蛋白(vesicle-associated membrane protein1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme E2L3)、天冬氨酰-tRNA合成酶(asparaginyl-tRNA synthetase)等。大多數(shù)的差異表達(dá)的基因都是下調(diào)表達(dá)（915個(gè)），例如熱休克蛋白(heat shock protein)、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transf

9、erase)以及小亞基核糖體蛋白(small subunit ribosomal protein S19e)等。本研究對(duì)巴氏新小綏螨進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組研究，獲得大量的基因數(shù)據(jù)，為從基因分子水平更深層次研究環(huán)境條件對(duì)巴氏新小綏螨影響提供支持。
　　3.在巴氏新小綏螨轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定出Hsps基因，共獲得21個(gè)unigene，熱激蛋白基因家族包括Hsp90、Hsp70、Hsp60、Hsp40及小Hsp家族。Hsp90家族有10條、Hsp70

10、家族有7條、Hsp60家族有2條、Hsp40家族及小Hsp家族各有1條。NbHsp90的開(kāi)放閱讀框?yàn)?142bp，編碼713個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)分子量為81.9kDa，等電點(diǎn)為5.08;NbHsp60的開(kāi)放閱讀框?yàn)?755bp，編碼583個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)分子量為62.2kDa，等電點(diǎn)為5.55;NbHsp40的開(kāi)放閱讀框?yàn)?206bp，編碼401個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)分子量為44.7kDa，等電點(diǎn)為6.21。與其它物種中已知的Hsps氨基酸

11、序列進(jìn)行相似性分析顯示巴氏新小綏螨熱激蛋白基因與西方盲走螨（Metaseiulus occidentalis）和其它昆蟲(chóng)相應(yīng)的氨基酸序列具有高度相似性。
　　4.利用熒光定量PCR技術(shù)，分別分析了不同溫度15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃及43℃處理下，未添加氨基酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨與添加亮氨酸飼養(yǎng)的巴氏新小綏螨雌成螨體內(nèi)NbHsp90、NbHsp60、NbHsp40三個(gè)基因的表達(dá)情況。結(jié)果表明，25℃恒溫條件下，未添