創(chuàng)作性腦損傷的基礎(chǔ)研究及相關(guān)腦脊液漏的臨床治療.pdf

1、創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)是全世界死亡和傷殘的首要原因。顱腦創(chuàng)傷所導(dǎo)致的腦代謝紊亂是嚴(yán)重威脅生命的重要原因，對其進(jìn)行廣泛而深入的研究有著重要的現(xiàn)實意義。事實上目前許多常用的模型與人類所發(fā)生的外傷在受力與外部條件上是有差別的。實驗?zāi)Ｐ统３?yīng)用頭部固定打擊，開顱手術(shù)后打擊，延長麻醉時間等方法，這些都會對顱腦損傷的發(fā)展產(chǎn)生影響，減少繼發(fā)性損傷，限制了顱內(nèi)壓(ICP)的監(jiān)測。我們目前制作了一種新的加速打擊腦外傷小鼠模型，稱為打擊運動模型。此模型不需

2、長時間麻醉，不用限制頭部運動，無需開顱手術(shù)，可以進(jìn)行顱內(nèi)壓監(jiān)測。損傷的嚴(yán)重程度可以通過氣動沖擊力來嚴(yán)格控制，設(shè)置不同的壓力可以產(chǎn)生高度一致的輕微、中度或重度顱腦損傷。通過觀察不同損傷程度的特征性病理組織學(xué)改變和行為缺陷，我們發(fā)現(xiàn)輕度腦外傷后動物表現(xiàn)出廣泛的皮質(zhì)和皮質(zhì)下膠質(zhì)細(xì)胞增生。雖然沒有證據(jù)顯示明確的皮質(zhì)中斷，血腦屏障開放，顱內(nèi)壓的變化或任何可察覺的認(rèn)知障礙，但是相比中重度腦外傷模型，輕度腦外傷動物表現(xiàn)出的短暫的腦白質(zhì)萎縮，彌漫性軸索

3、損傷和神經(jīng)元減少。并且輕度腦損傷出現(xiàn)一定程度的慢性感覺障礙伴隨彌漫性神經(jīng)損傷，這一結(jié)果強調(diào)了打擊運動模型與目前現(xiàn)有的腦損傷模型相比有很大的進(jìn)步，它使得我們可以對不同損傷程度的腦外傷(TBI)模型通過病理生理的研究進(jìn)行有效評估。同時顱腦外傷后腦脊液漏臨床十分常見，我們對顱腦外傷后造成的腦脊液漏進(jìn)行引流途徑的研究并通過對額竇骨折造成的腦脊液鼻漏應(yīng)用新的方法進(jìn)行有效的臨床治療。
　　 第一部分，創(chuàng)傷性腦損傷后小鼠腦白質(zhì)變性、神經(jīng)元缺失

4、及行為學(xué)變化的研究
　　 目的:
　　 建立小鼠輕度，中度或重度顱腦創(chuàng)傷實驗?zāi)Ｐ停瑢p傷后腦組織進(jìn)行組織學(xué)及行為學(xué)改變進(jìn)行分析研究。評估腦損傷后腦組織及血腦屏障破壞程度，神經(jīng)元缺失及軸突變性，并對損傷后小鼠行為學(xué)改變進(jìn)行分析研究。
　　 方法:
　　 所有實驗中均采用雄性C57BL/6小鼠，乙醚誘導(dǎo)麻醉后應(yīng)用改良控制性皮質(zhì)損傷設(shè)備(CCI)造成大腦創(chuàng)傷，采用不同的打擊速度制作不同程度的腦創(chuàng)傷模型，輕度4.

5、8米/秒，中度5.2米/秒和重度5.6米/秒。應(yīng)用2，3，5-三苯基氯化四氮唑(TTC)染色評價TBI后腦損傷的體積;伊文氏藍(lán)外滲技術(shù)評估血腦屏障破壞程度;免疫組化染色觀察創(chuàng)傷后腦部不同部位星形膠質(zhì)細(xì)胞，微小膠質(zhì)細(xì)胞，髓鞘堿性蛋白，磷酸化神經(jīng)纖維，神經(jīng)元的變化;干重-濕重法評估腦水腫的演變過程;并對顱內(nèi)壓及腦電活動進(jìn)行監(jiān)測，進(jìn)行一系列行為學(xué)測試。
　　 結(jié)果:
　　 1、打擊運動顱腦損傷模型的成功建立
　　 打擊

6、運動顱腦損傷模型首先的特點在于可以造成三種不同嚴(yán)重程度的損傷。僅需乙醚誘導(dǎo)麻醉后，迅速完成打擊過程（平均19.9±1.9秒，17-24秒，N=26）。輕度腦外傷動物的覺醒時間與對照組動物沒有顯著差異，而中度和重度腦外傷動物表現(xiàn)出明顯的蘇醒延遲（P＜0.01）。輕度到重度運動打擊模型從麻醉到蘇醒的整體時間范圍為4.5-6.5分鐘。未發(fā)現(xiàn)有造模過程導(dǎo)致急性死亡。366只小鼠造模共有16只死亡，其中輕度1只，中度1只，重度14只。
　　

7、 2、損傷后不同程度組織破壞及血腦屏障的改變
　　 2.1、重度損傷組發(fā)現(xiàn)10.8％(16/148)有明顯凹陷性顱骨骨折，但在輕度或中等損傷組沒有觀察到顱骨骨折。中度和重度組發(fā)現(xiàn)同側(cè)硬膜下和/或蛛網(wǎng)膜下腔出血、明顯挫傷，往往累積深部皮層及相關(guān)腦白質(zhì)。
　　 2.2、腦外傷24小時后伊文氏藍(lán)染色，輕度損傷組并沒有表現(xiàn)出明顯的損傷，而中度損傷只表現(xiàn)在小的損傷灶。相比輕度和中度損傷，重度腦外傷導(dǎo)致顯著的大范圍組織損傷與缺失，

8、占對側(cè)半球的體積近75％。
　　 3、損傷后反應(yīng)性膠質(zhì)細(xì)胞的演變
　　 輕度腦外傷動物，彌漫GFAP和CD68免疫標(biāo)記僅在局部受損傷一側(cè)表達(dá)，穿透深度的皮質(zhì)，皮質(zhì)下白質(zhì)，涉及紋狀體，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞與反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞區(qū)域重疊，但一般僅限于皮層表面。3天后輕度膠質(zhì)細(xì)胞增生并在第7天達(dá)到高峰。14天仍有表達(dá)，但在TBI后28天大部分消失。輕度腦外傷動物在任何時間點未發(fā)現(xiàn)明顯膠質(zhì)瘢痕或?qū)?cè)腦損傷。重度腦外傷與中度的傷害相類似

9、，但范圍更加廣泛，涵蓋了同側(cè)皮質(zhì)，皮質(zhì)下白質(zhì)，紋狀體和海馬前部。對沖性損傷也明顯位于皮質(zhì)紋狀體且范圍更大。
　　 4、損傷后神經(jīng)元缺失和軸突變性
　　 4.1、NeuN缺失輕度損傷后在任何時間點沒有發(fā)現(xiàn)皮質(zhì)或皮質(zhì)下體積改變。中度損傷后，皮層組織中神經(jīng)元第7天開始減少。輕度損傷組在內(nèi)的所有不同程度腦損傷在3天和7天均有明顯的神經(jīng)元缺失，但不同損傷等級之間并沒有統(tǒng)計學(xué)差異。重型顱腦損傷的動物除了組織的破壞和萎縮外，類似的損失

10、是顯而易見的，并且不同損傷組均有著劑量依賴性。
　　 4.2、免疫標(biāo)記磷酸化神經(jīng)絲(SMI-34)，傷后14天通過對免疫磷酸化神經(jīng)纖維(SMI-34)的觀察分析發(fā)現(xiàn)同側(cè)皮質(zhì)和皮層下白質(zhì)存在軸突變性。中度頭部外傷后軸突變性更廣泛，輕度腦外傷動物也可以觀察到。
　　 4.3、髓鞘堿性蛋白(MBP)在中度腦外傷后14天GFAP陽性免疫反應(yīng)周邊區(qū)域，MBP在皮質(zhì)的表達(dá)較對側(cè)鏡像區(qū)相對中斷和不連續(xù)，重度損傷后14天皮質(zhì)脫髓鞘更加嚴(yán)

11、重。
　　 5、腦水腫輕度損傷模型在任何時間點均未發(fā)現(xiàn)腦水腫。相比之下，重度損傷模型腦組織同側(cè)和對側(cè)半球含水量在1和3天顯著升高，而中度損傷后只在同側(cè)半球有顯著升高。對側(cè)并沒有表現(xiàn)出顯著的腦水腫。在腦外傷7天后，重型顱腦損傷的對側(cè)和中型顱腦損傷的同側(cè)腦水腫均消退，但重型顱腦損傷動物的同側(cè)仍升高。
　　 6、顱內(nèi)壓(ICP)中度損傷后ICP迅速增加并在傷后3天達(dá)到頂峰。除了ICP峰值和谷值均相對增高外，受傷后1天ICP脈搏

12、波振幅也顯著升高?；驹趥?-6天回復(fù)正常水平。
　　 7、外傷后癲癇發(fā)作的評價腦電活動在更高的頻段上沒有明顯改變，沒有檢測到創(chuàng)傷后癲癇樣活動，且在發(fā)生在尖峰內(nèi)的癲癇樣活性增強沒有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 8、行為學(xué)評估
　　 8.1、神經(jīng)學(xué)評分
　　 模型組在傷后3小時后表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)功能損傷，中度和輕度損傷相對重度損傷分?jǐn)?shù)要高，輕度腦外傷動物恢復(fù)快，24小時后基本恢復(fù)正常水平，中度在3天之間恢復(fù)，重型顱

13、腦損傷的動物傷后3至7天逐漸恢復(fù)。
　　 8.2、旋轉(zhuǎn)試驗（Rotarodtest）對照組動物協(xié)調(diào)性有明顯提高，反映除了運動學(xué)習(xí)性能外完整的運動協(xié)調(diào)性。相比之下，中/重度TBI動物未能改善，一周后表現(xiàn)出持續(xù)的運動功能缺陷。
　　 8.3、曠場試驗對照組與各模型組無統(tǒng)計學(xué)意義。從而說明了在創(chuàng)傷性腦外傷中旋轉(zhuǎn)實驗反應(yīng)了受損的運動學(xué)習(xí)功能而不是簡單的運動缺陷。
　　 8.4、新奇物識別實驗在全程五周實驗中對照組動物表現(xiàn)

14、出穩(wěn)定的對新物體的識別，輕度損傷表現(xiàn)正常，然而中度/重度TBI動物表現(xiàn)出對新事物辨識顯著和持續(xù)的下降。
　　 8.5、巴恩斯迷宮(Barnesmaze)實驗?zāi)X外傷28天后。在連續(xù)3天的實驗，對照組小鼠完成實驗的時間明顯縮短。輕度損傷小鼠與對照組相比無明顯差別，然而中度/重度腦外傷小鼠表現(xiàn)出明顯的認(rèn)知障礙(P＜0.05)。此外，與新奇物識別實驗測試結(jié)果一致，輕度腦外傷動物沒有表現(xiàn)出任何的認(rèn)知缺陷，中度和重度TBI表現(xiàn)出長期運動和認(rèn)

15、知功能障礙。
　　 結(jié)論:
　　 新TBI模型具有以下特點:(1)小鼠在受到打擊后頭部和身體可以自由運動，受力機(jī)制類似于現(xiàn)實生活中的意外傷害。(2)無需進(jìn)行任何造模前的手術(shù)準(zhǔn)備;(3)小鼠只需2-3min的誘導(dǎo)麻醉;(4)顱骨仍然閉合，避免顱骨骨折;(5)損傷程度可控性，包括輕度腦損傷特點:廣泛的膠質(zhì)細(xì)胞增生和腦白質(zhì)變性?？傮w而言，這種簡單的模型以造成穩(wěn)定的腦白質(zhì)病變伴隨神經(jīng)元的缺失，對不同程度損傷后的腦代謝改變的深入研

16、究有重要意義，將對神經(jīng)保護(hù)性試驗研究產(chǎn)生十分有利的作用。
　　 第二部分，創(chuàng)傷性腦損傷(TBI)后水通道蛋白(AQP4)功能失調(diào)的動態(tài)改變及星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)區(qū)域AQP4表達(dá)的復(fù)雜變化
　　 目的:
　　 研究輕度及中度顱腦損傷后AQP4的動態(tài)改變和星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)區(qū)域AQP4表達(dá)的復(fù)雜變化。
　　 方法:
　　 10-12周齡的雄性C57BL/6小鼠，應(yīng)用改良控制性皮層打擊設(shè)備造模，通過免疫組化染

17、色分析膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP），小膠質(zhì)細(xì)胞(CD68)，神經(jīng)元標(biāo)記物(NeuN)，神經(jīng)絲蛋白磷酸化標(biāo)記物(SMI-34)，水通道4(AQP4)和髓鞘堿性蛋白(MBP)損傷后的變化。
　　 結(jié)果:
　　 1、輕、中度顱腦創(chuàng)傷模型的建立'輕度'和'中度'的腦損傷皮質(zhì)撞擊速度為4.8米/秒和5.2米/秒，深度和接觸時間均保持不變（見第一部分）。
　　 2、創(chuàng)傷后膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性改變
　　 輕度腦外傷動物3天傷

18、后，打擊部位星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)和小膠質(zhì)細(xì)胞(CD68)彌漫反應(yīng)性增生(Fig.1B)。輕度腦外傷動物在任何時間點沒有明顯的膠質(zhì)瘢痕出現(xiàn)，皮質(zhì)改變在中度損傷后3天明顯7天達(dá)到高峰，在7天形成明確的膠質(zhì)瘢痕。
　　 3、TBI后脫髓鞘和軸突變性
　　 輕度損傷在任何時間點沒有發(fā)現(xiàn)明顯的皮質(zhì)或皮質(zhì)下體積改變(Fig.2A-B)，中度損傷后，皮層組織在傷后第7天出現(xiàn)改變(Fig.2A*P＜0.05比對照)。輕度和中度頭部外

19、傷，包括胼胝體，外囊，皮質(zhì)下白質(zhì)有短暫的萎縮，在傷后第7天達(dá)到高峰（Fig.2C*P＜0.05vs.對照）在14天趨于穩(wěn)定。在膠質(zhì)原纖維酸性蛋白免疫反應(yīng)性的中度病變周圍的區(qū)域，MBP較對側(cè)表達(dá)明顯減弱。（Fig.2D-F;*P＜0.05vs.對照組）。磷酸化神經(jīng)纖維(SMI-34)在傷后14天出現(xiàn)同側(cè)皮質(zhì)和皮質(zhì)下白質(zhì)軸突變性。輕度損傷也出現(xiàn)廣泛軸突變性，但中度損傷更為明顯(Fig.2I)。
　　 4、顱腦損傷后AQP4在局部的皮

20、層和紋狀體的表達(dá)發(fā)生復(fù)雜的變化。輕度損傷中AQP4在全腦的表達(dá)與血管周圍AQP4表達(dá)均有明顯減少。損傷后7天膠質(zhì)瘢痕的形成使得AQP4上調(diào)表達(dá)增加，且AQP4的表達(dá)失調(diào)與星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性改變有關(guān)。
　　 結(jié)論:
　　 創(chuàng)傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞AQP4表達(dá)表現(xiàn)出明顯的去極化，AQP4失調(diào)可能并不導(dǎo)致創(chuàng)傷后腦水腫和ICP的變化發(fā)展，而可能是一種代償性反應(yīng)。從輕度顱腦損傷后反應(yīng)性星形膠質(zhì)形成伴隨AQP4功能失調(diào)來看，可以針對

21、膠質(zhì)細(xì)胞增生的治療途徑使AQP4表達(dá)正?；?，減少中度或重度腦外傷創(chuàng)傷后癲癇發(fā)作的易感性，有利于腦內(nèi)代謝廢物的清除。
　　 第三部分，顱腦損傷后(TBI)腦脊液漏的基礎(chǔ)研究及臨床治療
　　 目的:
　　 對顱腦外傷后造成腦脊液漏進(jìn)行引流途徑研究并對額竇骨折造成的腦脊液鼻漏通過經(jīng)皮注射纖維蛋白膠治療的方法進(jìn)行臨床評估。
　　 方法:
　　 影像學(xué)分析額竇鼻腔開口及其解剖學(xué)相關(guān)引流途徑，對目前顱腦創(chuàng)傷所

22、導(dǎo)致的難治性腦脊液鼻漏進(jìn)行影像學(xué)定位診斷，并分析經(jīng)皮注射纖維蛋白膠治療額竇骨折腦脊液鼻漏的方法進(jìn)行圍手術(shù)期觀察及預(yù)后的評估。
　　 結(jié)果:
　　 對顱腦創(chuàng)傷導(dǎo)致額竇腦脊液鼻漏的基礎(chǔ)研究有助于發(fā)現(xiàn)新的治療途徑。經(jīng)皮穿刺注射纖維蛋白膠是有效治療額竇腦脊液鼻漏的新方法。手術(shù)時間為27.6±7.98分鐘，平均住院為11.25±4.99天，隨訪平均為11.5個月未見復(fù)發(fā)。
　　 結(jié)論:
　　 對顱腦創(chuàng)傷導(dǎo)致額竇腦脊