藥用植物天麻Gastrodia elta B1遺傳多樣性及化學(xué)成分的初步研究.pdf

1、天麻(Gastrodia elata B1)是蘭科(Orchidaceae)多年生共生草本植物，廣泛分布于我國(guó)吉林和遼寧東部、內(nèi)蒙古、河南西北部、云南、四川、貴州、西北等地，在日本、韓國(guó)、尼泊爾、不丹也有廣泛分布，主要生長(zhǎng)于海拔400-3200米的疏林下、林中空地、林緣和灌叢邊緣，是中國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥。實(shí)驗(yàn)證明天麻素是天麻的主要活性成分之一。本研究運(yùn)用AFLP和ISSR分子標(biāo)記對(duì)不同分布區(qū)天麻遺傳多樣性和居群的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為天麻資

2、源合理保護(hù)利用及優(yōu)良種質(zhì)資源的選育奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，運(yùn)用HPLC等方法對(duì)不同產(chǎn)地天麻中的天麻素及無機(jī)元素含量進(jìn)行比較；運(yùn)用GC-MS分析了天麻的揮發(fā)性成分。主要結(jié)果如下： 在AFLP研究中，從貴州、云南、四川、陜西和遼寧收集了27份天麻樣品，從64對(duì)AFLP選擇性引物組合中篩選出16對(duì)引物組合，對(duì)不同分布區(qū)天麻及天麻不同變型的遺傳多樣性進(jìn)行分析。16對(duì)引物共產(chǎn)生548條大小在100-2500bp的譜帶，其中多態(tài)性帶428條，多態(tài)性

3、比率(PP)達(dá)78％。該結(jié)果說明天麻中存在較為豐富的遺傳多樣性，且AFLP可以有效地進(jìn)行天麻遺傳多樣性的分析。遺傳差異分析結(jié)果表明，27個(gè)樣品的遺傳距離在0.54～0.018之間，平均為0.2199，表明不同分布區(qū)天麻個(gè)體問存在一定的遺傳差異。四個(gè)省區(qū)的樣品中來自貴州的樣品遺傳差異相對(duì)較大，遺傳距離最大的是大方(6號(hào))與施秉(8號(hào))之間，其遺傳距離為0.5934，遺傳距離最小的是桐梓(11號(hào))與梵凈山(10號(hào))之間，其遺傳距離為0.03

4、38。表明貴州蘊(yùn)藏著相對(duì)豐富的基因資源，因而可以作為天麻遺傳改良的重要種質(zhì)資源。對(duì)同一來源不同變型的天麻的AFLP分析結(jié)果表明，天麻種內(nèi)的變型僅僅是表型上的變異，遺傳距離在0.0224～0.0570之間，表現(xiàn)出較小的遺傳差異，這表明分類學(xué)上的幾種變型僅僅是表型上的變異，沒有在分子水平上發(fā)生的根本變異。這可能是同一基因型由于環(huán)境條件的改變?cè)诒硇蜕习l(fā)生的變化，尚未在遺傳上固定下來。對(duì)天麻幾個(gè)變型的劃分是否成立還有待進(jìn)一步研究。把包括海拔高度

5、、經(jīng)度、緯度、年均降雨量和年均氣溫在內(nèi)的環(huán)境因子劃分為不同的范圍，用.POPGEN軟件分別分析不同環(huán)境因子范圍下天麻居群的遺傳多樣性，結(jié)果表明處于不同環(huán)境因子下的天麻呈現(xiàn)出遺傳多樣性一定的差異，但遺傳樣性與上述環(huán)境因子的之間并無明顯的相關(guān)性。環(huán)境因子對(duì)天麻群體間產(chǎn)生的遺傳變異僅占總變異的9.47％至26.41％，而73.59％～90.53％的變異來自于各居群內(nèi)。利用ISSR(inter-simple sequence repeat)分子

6、標(biāo)記技術(shù)，對(duì)分布于貴州(Gastrodia elata B1.)9個(gè)居群的天麻遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。12條ISSR引物共擴(kuò)增出120條大小在200bp-1600bp清晰的譜帶，其中97條具有多態(tài)性，總的多態(tài)位點(diǎn)百分率為80.83％，表明在物種水平上有較高的遺傳變異。居群水平的多態(tài)性相對(duì)較低，多態(tài)百分率在17.5％～40.83％之間，平均25.56％。用POPGENE軟件計(jì)算各居群?jiǎn)柡途尤簝?nèi)的遺傳參數(shù)，結(jié)果表明：物種水平上的N

7、ei's遺傳多樣性(H<,E>)為0.042-0.153，平均0.073。Shannon信息指數(shù)為0.3326±0.2241。Nei's基因分化系數(shù)(Gst)為0.6377,表明居群間的遺傳變異占總變異的63.77％，而居群內(nèi)的遺傳變異占總變異的36.33％，這與有限的基因流有關(guān)。天麻居群間的基因流較為有限(Nm=0.2841)，明顯低于異花傳粉植物的平均值，這表明天麻的基因流不足。種子生活力低可能降低了因種子傳播而產(chǎn)生的基因流。加之，

8、傳播出去的天麻種子需要吸收小菇屬真菌的營(yíng)養(yǎng)才能萌發(fā)菌，這也造成天麻居群間較低的基因流動(dòng)。基因流不足和種子的傳播距離、種子極低的生活率以及居群間的地理隔離和營(yíng)養(yǎng)繁殖等因素可能是導(dǎo)致天麻居群遺傳分化的主要原因。 在不同產(chǎn)地天麻和無機(jī)元素含量的比較研究中，從14個(gè)不同分布區(qū)采集了17個(gè)野生和栽培的天麻樣本，采用藥典天麻素的提取方法，提取天麻素，并采用高效液相色譜法對(duì)其含量進(jìn)行了測(cè)定。并比較各產(chǎn)地栽培和野生天麻中主要藥用成分天麻素的含量

9、。結(jié)果表明， 14個(gè)分布區(qū)的17個(gè)天麻樣品天麻素含量在0.1603％到2.5513％之間。野生天麻中的天麻素含量明顯高于栽培天麻，野生天麻的天麻素平均含量為1.702％，而栽培天麻的天麻素平均含量為0.576％。同一產(chǎn)地的野生和栽培天麻其天麻素的含量也有差異，說明良好的栽培措施有利于天麻素的提高，而不同生長(zhǎng)環(huán)境也是影響天麻素的含量的重要因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示，野生天麻和人工栽培天麻的天麻素含量都超過《中國(guó)藥典》的標(biāo)準(zhǔn)，符合國(guó)家用藥標(biāo)準(zhǔn)。此

10、外，本研究還對(duì)天麻中的N、P、K、Ca、Mg、 Fe、Mn、Cu、Zn以及重金屬元素Pb、Cd的含量進(jìn)行測(cè)定，以便為天麻的質(zhì)量評(píng)估提供依據(jù)。結(jié)果表明，N的含量在4.63-14.52g/kg，磷的含量平均為1.11g/kg，鐵的含量差異最大，重金屬元素鉛和鎘的含量在0.24-1.73 mg/kg和0.19-0.80mg/kg。SPSS軟件多因子相關(guān)性分析結(jié)果表明，11種元素中與天麻素含量相關(guān)性較為明顯的元素是氮元素(r=0.632420；

11、p=0.085643)，其余元素含量與天麻素的含量無相關(guān)性。 運(yùn)用水蒸汽蒸餾法首次從天麻次生塊莖(箭麻)中提取揮發(fā)性成分，并用氣相色譜質(zhì)譜法(GC-MS)對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行分離鑒定，并用面積歸一化計(jì)算各成分相對(duì)含量。杯碟法進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示：從紅天麻中共有42個(gè)成分，其中已知成分有14種，其質(zhì)量占總質(zhì)量的63.189％。綠天麻共有48個(gè)成份，確定成分的有29種，質(zhì)量占總質(zhì)量的84.313％。烏天麻有36個(gè)成份，20種成分已確定，

12、占76.392％。紅天麻中的主要成分是2，3，5，6一四甲基吡嗪(25.331％)、2一戊基呋哺(11.974％)和E，E-2，4-癸二烯醛(8.66％)。綠天麻揮發(fā)油的主要成分是亞油酸乙酯(15.444％)、苯乙烯(10.352％)和棕櫚酸乙酯(10.066％)。烏天麻中主要包括4-甲基-苯酚(20.409％)、苯乙烯(12.607％)、1-甲乙醚十六烷酸(8.842％)。比較三種天麻的揮發(fā)油成分，有6種共有成分，這6種共有成分可以作