多重鏈置換擴(kuò)增在脊髓性肌萎縮、β地中海貧血單細(xì)胞診斷中的應(yīng)用研究.pdf

1、β地中海貧血和脊髓性肌萎縮是兩種常見的單基因遺傳病。其中β地中海貧血是是我國(guó)南方常見的一種常染色體隱性遺傳、血紅蛋白異常性疾病，攜帶率約為2.8％。該病由于珠蛋白基因缺失或突變導(dǎo)致。Β珠蛋白基因簇位于人11號(hào)染色體上，包含5個(gè)功能基因和1個(gè)假基因，這些基因的突變導(dǎo)致血紅蛋白合成異常而發(fā)病。全世界約發(fā)現(xiàn)200多種突變，我國(guó)大約有28種突變。地貧基因的突變會(huì)導(dǎo)致貧血及后續(xù)的器官損害，嚴(yán)重危害人的生命。SMA是一種常見的致死性常染色體隱性遺傳

2、性疾病，其發(fā)病率約1/6000-1/10000。人群攜帶率約1/40-1/50。染色體5q13的脊髓性肌萎縮運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元生存基因(survival motor neuron gene 1，smn1)的缺失是導(dǎo)致SMA發(fā)病的主要病因。Smn1基因的突變使脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退變而導(dǎo)致肌無力和肌萎縮，由于肌肉漸進(jìn)性的退化，患者走路、爬行、吞咽、甚至呼吸等功能都會(huì)逐漸喪失，常因呼吸衰竭而死亡。上面兩種疾病至今仍缺乏有效的治療方法?，F(xiàn)在一般使用產(chǎn)前診斷

3、的方法來減少患兒的出生。然而，產(chǎn)前診斷需要終止妊娠，給孕婦及家庭帶來巨大的傷害。
　　 胚胎植入前診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)是一種基于試管嬰兒的技術(shù)發(fā)展起來的不同于產(chǎn)前診斷的診斷方法。PGD通過對(duì)體外授精形成胚胎進(jìn)行細(xì)胞活檢，使用PCR或者熒光原位雜交等技術(shù)，進(jìn)行遺傳病的診斷，根據(jù)結(jié)果移植合適的胚胎到宮腔中的一種技術(shù)，這種技術(shù)可以避免產(chǎn)前診斷所需要的終止妊娠。根據(jù)歐洲人類生

4、殖與胚胎協(xié)會(huì)PGD分會(huì)的統(tǒng)計(jì)，目前全世界實(shí)行PGD周期總數(shù)超過20,000例，成功分娩6,000多個(gè)健康胎兒。為許多患者夫婦帶來了希望。
　　 已經(jīng)有許多對(duì)β地中海貧血和SMA進(jìn)行植入前診斷的報(bào)道。如通過使用單鏈構(gòu)象多態(tài)性、變性梯度凝膠電泳、熒光PCR(Fluorescence PCR，F(xiàn)-PCR)、巢式PCR、連鎖分析結(jié)合微小測(cè)序等方法進(jìn)行β地中海貧血的單細(xì)胞診斷和植入前診斷；通過限制性酶切、等位基因特異性PCR(allele

5、-specific PCR，AS-PCR)、熒光PCR(Fluorescence PCR，F(xiàn)-PCR)、微小測(cè)序等方法進(jìn)行SMA的植入前診斷。然而上述的方法都基于單細(xì)胞診斷技術(shù)，因此具有一些缺點(diǎn)，如只能同時(shí)擴(kuò)增少量基因位點(diǎn)、樣本不能保留、每種反應(yīng)體系都需要進(jìn)行優(yōu)化、高等位基因脫扣率(allele drop out，ADO)等。
　　 為了解決這個(gè)問題，全基因組擴(kuò)增技術(shù)(whole genome amplication，WGA)用

6、于擴(kuò)增單細(xì)胞全基因組DNA已經(jīng)引入到PGD之中。WGA的方法有許多種，如引物延伸預(yù)擴(kuò)增聚合酶鏈反應(yīng)(primer extension preamplification PCR，PEP-PCR)，簡(jiǎn)并寡核苷酸引物聚合酶鏈反應(yīng)(degenerate oligonucleotide primed PCR，DOP-PCR)，多重鏈置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification，MDA)等。PEP-PCR和DOP

7、-PCR都是基于PCR為基礎(chǔ)的，因此其具有基因組覆蓋不完全高ADO率、擴(kuò)增片段短不適用于需要高質(zhì)量模板的后續(xù)基因分析方法等缺點(diǎn)。MDA是目前為止最好的WGA方法。其最早由Lizardi博士建立，主要基于Phi29 DNA聚合酶的恒溫鏈置換擴(kuò)增原理，具有恒溫?cái)U(kuò)增、擴(kuò)增片段長(zhǎng)、基因組覆蓋度高等優(yōu)點(diǎn)。
　　 研究目的：
　　 本研究通過使用AS-PCR、微衛(wèi)星分析、反向斑點(diǎn)雜交(reverse dot blot，RDB)比較不

8、同MDA孵育時(shí)間對(duì)擴(kuò)增成功率、ADO率影響，優(yōu)化MDA的孵育時(shí)間。同時(shí)通過結(jié)合MDA、AS-PCR，微衛(wèi)星分析對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行SMA診斷；結(jié)合MDA、RDB對(duì)β地中海貧血進(jìn)行診斷，建立結(jié)合MDA對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行SMA和β地中海貧血診斷的方法，為日后建立SMA、β地中海貧血的植入前診斷平臺(tái)打下基礎(chǔ)。
　　 材料：
　　 取本研究所建立的5株成纖維細(xì)胞系做為研究材料。其中，有兩株smn1基因純合缺失成纖維細(xì)胞(S1和S2)；1株β4

9、1-42/β17雙重雜合突變?chǔ)碌刂泻Ｘ氀衫w維細(xì)胞(TH1)；1株β41-42/β41-42純合突變?chǔ)碌刂泻Ｘ氀衫w維細(xì)胞(TH2)；1株正常人包皮成纖維細(xì)胞(N1)。這些細(xì)胞的突變類型均事先通過基因檢測(cè)明確診斷。共取得49個(gè)單個(gè)成纖維細(xì)胞。其中包括13個(gè)TH1單個(gè)成纖維細(xì)胞，10個(gè)TH2單個(gè)成纖維細(xì)胞，8個(gè)S1單個(gè)成纖維細(xì)胞，10個(gè)S2單個(gè)成纖維細(xì)胞。8個(gè)N1單個(gè)成纖維細(xì)胞。
　　 方法:
　　 1.單個(gè)細(xì)胞制備

10、>　　 2.將細(xì)胞分為16小時(shí)孵育組和4小時(shí)孵育組進(jìn)行單細(xì)胞MDA擴(kuò)增
　　 3.應(yīng)用AS-PCR對(duì)MDA產(chǎn)物進(jìn)行smn1和smn2基因的檢測(cè)
　　 4.應(yīng)用單重?zé)晒釶CR法對(duì)MDA產(chǎn)物擴(kuò)增smn1基因緊密連鎖的兩個(gè)STR位點(diǎn)D5S351、D5S435
　　 5.應(yīng)用RDB法對(duì)MDA產(chǎn)物進(jìn)行β地中海貧血的18 種β地貧突變位點(diǎn)的檢測(cè)
　　 結(jié)果：
　　 1.MDA單個(gè)成纖維細(xì)胞的總擴(kuò)增率89.3

11、％(342/383)，smn1基因的總擴(kuò)增成功率為90.48％(19/21)，smn2基因的擴(kuò)增成功率為94.87％ (37/39)。D5S351和D5S435的擴(kuò)增成功率分別為94.87％ (37/39)，87.18％ (34/39)。結(jié)合MDA、STR、AS-PCR對(duì)SMA進(jìn)行PGD的總的擴(kuò)增成功率為92.02％(127/138)。RDB檢測(cè)擴(kuò)增成功率為88％ (220/250)?？侫DO率是13.92％(11/79)，D5S351

12、的ADO率是16.22％ (6/37)，D5S435的ADO率是12.5％(2/16)，結(jié)合MDA、STR、AS-PCR對(duì)SMA進(jìn)行PGD的總ADO率為15.09％(8/53)，RDB的ADO率是11.54％(3/26)。
　　 2.16小時(shí)組與4小時(shí)組在擴(kuò)增成功率方面分別為90.48％ (171/189)和88.14％ (171/194)，結(jié)果無顯著性差異(χ2檢驗(yàn),P>0.05)；16小時(shí)組和4小時(shí)組的ADO率分別為17.0

13、7％ (7/41)和10.53％ (4/38)，兩者比較結(jié)果無顯著性差異(χ2檢驗(yàn),P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.本研究通過比較不同MDA孵育間對(duì)擴(kuò)增成功率、ADO率的影響。使MDA的孵育時(shí)間降低到4個(gè)小時(shí)。使整個(gè)單細(xì)胞基因診斷時(shí)間縮短。為日后運(yùn)用于植入前診斷創(chuàng)造了有利的條件。
　　 2.首次使用結(jié)合MDA、等位基因特異性PCR和STR分析的方法對(duì)單細(xì)胞SMA進(jìn)行診斷。該方法可以診斷出smn1基因純合