基于微流控芯片技術(shù)COPD向肺鱗癌惡性轉(zhuǎn)化的機(jī)制研究.pdf

1、背景:近年來，慢性肺部疾患，包括慢性支氣管炎、哮喘、肺結(jié)核、肺部瘢痕病灶、塵肺等作為與肺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的重要因素越來越被肯定和關(guān)注。統(tǒng)計顯示，患有慢性阻塞性肺病(COPD)的患者，其肺癌發(fā)病率是一般人群的4～5倍，因此，目前COPD已經(jīng)被認(rèn)為是誘發(fā)肺癌的獨立危險因素。在COPD誘發(fā)肺部癌變過程中，慢性炎癥主要通過改變腫瘤細(xì)胞的生存環(huán)境、激活，由多種蛋白及炎性介質(zhì)參與的內(nèi)源性或外源性信號通路等途徑促進(jìn)癌癥的發(fā)生與發(fā)展。然而從COPD向肺鱗

2、癌的惡性轉(zhuǎn)化過程中究竟有哪些炎癥因子或者炎癥相關(guān)的分子通路、網(wǎng)絡(luò)在起作用仍不清楚。
　　為了進(jìn)一步揭示慢性炎癥惡性轉(zhuǎn)化的本質(zhì)，我們不僅要注重研究與該過程相關(guān)聯(lián)的信號通路和關(guān)鍵因子，也要注重研究方式及研究手段的改進(jìn)?，F(xiàn)有研究方法的根本不足在于所采用的技術(shù)方式?jīng)]能很好地模擬體內(nèi)真實的炎癥微環(huán)境，導(dǎo)致體外研究結(jié)果不可靠。因此，為了探討COPD向肺癌惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制，迫切需要一種能夠較好地模擬體內(nèi)微環(huán)境、同時檢測多種炎癥因子、實現(xiàn)高通量

3、檢測的新技術(shù)手段，以提高檢測的準(zhǔn)確性和可靠性，為肺部疾患惡性轉(zhuǎn)化機(jī)制的研究提供客觀的依據(jù)。發(fā)展中的微流控芯片技術(shù)能夠滿足上述要求，可望為這種檢測提供可靠的技術(shù)支持，成為研究肺癌機(jī)制新的技術(shù)平臺。因此，本研究擬充分發(fā)揮微流控芯片技術(shù)的優(yōu)勢，在微流控芯片平臺上完成COPD向肺鱗癌惡性轉(zhuǎn)化的分子機(jī)制研究，同時輔以動物體內(nèi)實驗加以驗證，為肺部慢性炎癥惡性轉(zhuǎn)化尋找潛在的分子靶點。本研究分為以下四部分。
　　研究方法:
　　1.基于微流

4、控芯片技術(shù)可疑致癌炎癥因子的高通量篩選
　　構(gòu)建了一個適于肺癌組織和癌旁組織炎癥因子篩選的高通量的三維細(xì)胞培養(yǎng)微流控芯片平臺，選取57例肺鱗癌合并COPD的患者為研究對象，進(jìn)行了微流控芯片平臺上細(xì)胞三維培養(yǎng)、炎癥因子檢測，同時利用傳統(tǒng)分子生物學(xué)技術(shù)Westernblot、real-timePCR、免疫組織化學(xué)檢測了肺癌組織和癌旁組織炎癥因子的差異。
　　2.基于微流控芯片技術(shù)COPD香煙再暴露致惡性轉(zhuǎn)化的研究
　　構(gòu)建

5、了一個適于支氣管上皮細(xì)胞香煙再暴露研究的微流控芯片平臺，選取10例肺鱗癌合并COPD并有長期吸煙史的患者為研究對象，進(jìn)行了支氣管上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)，在微流控芯片平臺上對已有長期香煙暴露史的支氣管上皮再次進(jìn)行香煙的暴露，觀察在長期香煙再暴露過程中支氣管上皮細(xì)胞是否發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，檢測活性氧(ROS)水平、相關(guān)分子通路變化、錨著獨立性、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)以及染色體畸變。
　　3.基于仿生肺芯片NF-κB、COX2、STAT3、GRP7

6、8在支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用研究
　　構(gòu)建了一個模擬人體肺部結(jié)構(gòu)的仿生肺芯片，支氣管上皮細(xì)胞系16HBE與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，其中上皮細(xì)胞采用“氣液界面”培養(yǎng)，苯并芘致癌物誘導(dǎo)上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，同時抑制NF-κB、COX2、STAT3、GRP78等相關(guān)分子水平，檢測上皮細(xì)胞惡變的指標(biāo)如細(xì)胞形態(tài)學(xué)、細(xì)胞周期、錨著獨立性、裸鼠成瘤以及相關(guān)分子通路變化，觀察炎癥是否促進(jìn)了上皮細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，驗證炎癥相關(guān)因子的致癌作用。
　　4.基

7、于動物肺癌模型NF-κB、COX2、STAT3、GRP78在支氣管上皮惡性轉(zhuǎn)化的作用研究
　　采用熏煙聯(lián)合脂多糖(LPS)支氣管灌注的方法建立了大鼠COPD模型，在此基礎(chǔ)上又利用致癌物三甲基膽蒽(MCA)和二乙基亞硝胺(DEN)支氣管灌注法建立了大鼠肺癌模型，同時采用體內(nèi)RNA干擾技術(shù)將大鼠體內(nèi)NF-κB、COX2、STAT3、GRP78下調(diào)，觀察比較單純致癌組、COPD致癌組以及RNA干擾后大鼠肺癌發(fā)生率的差異從而驗證上述四個因

8、子是否是炎癥向腫瘤惡性轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵節(jié)點。
　　結(jié)果:
　　1.基于微流控芯片技術(shù)可疑致癌炎癥因子的高通量篩選
　　成功構(gòu)建了一個能夠進(jìn)行炎癥惡性轉(zhuǎn)化研究的多單元集成、雙水平對照、多通道連接的高通量微流控芯片實驗室，在此平臺上完成了57例肺鱗癌患者原代肺癌細(xì)胞和癌旁支氣管上皮細(xì)胞三維培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)p-IKKβ、p-IκBα、NF-κB、GRP78、p-IRE1α、XBP1、COX2、STAT3及CyclinD1在肺癌細(xì)胞中的表

9、達(dá)要明顯高于癌旁支氣管上皮細(xì)胞的表達(dá)(P＜0.05)，免疫組織化學(xué)檢測、Westernblot檢測以及real-timePCR檢測結(jié)果與上述芯片平臺篩選結(jié)果一致。
　　2.基于微流控芯片技術(shù)COPD香煙再暴露致惡性轉(zhuǎn)化的研究
　　成功構(gòu)建了一個自動多濃度梯度發(fā)生的香煙再暴露微流控芯片平臺，研究發(fā)現(xiàn)低劑量CSE暴露可導(dǎo)致人支氣管上皮細(xì)胞增殖速度加快，同時伴有胞漿ROS產(chǎn)生以及ROS相關(guān)炎癥通路GRP78/IRE1α，IKKα/

10、NF-κB和PI3K/AKT/mTOR的激活，長期低劑量CSE暴露還可以導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞表現(xiàn)為病理性核分裂象增多的高度異型性狀態(tài)，同時還可以促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、錨定獨立性生長以及染色體畸變，而應(yīng)用ROS、GRP78、NF-κB以及PI3K抑制劑后，上述各個指標(biāo)的變化被逆轉(zhuǎn)或減弱。
　　3.基于仿生肺芯片NF-κB、COX2、STAT3、GRP78在支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用研究
　　成功構(gòu)建了一個模擬體內(nèi)肺臟結(jié)構(gòu)的仿生肺

11、芯片，研究發(fā)現(xiàn)支氣管上皮細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后培養(yǎng)基中IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯高于單獨支氣管上皮細(xì)胞培養(yǎng)的水平，且隨著傳代次數(shù)的增加各因子水平隨之升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);苯并芘可以導(dǎo)致支氣管上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)惡變、細(xì)胞周期加快、接觸抑制消失、錨著獨立性生長以及裸鼠成瘤等惡性表現(xiàn)，而巨噬細(xì)胞可以加速支氣管上皮細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，表現(xiàn)為上述各個指標(biāo)出現(xiàn)的代次提前，抑制NF-kB、STAT3、COX2、GRP78相關(guān)炎

12、癥因子后，上述各個指標(biāo)出現(xiàn)的代次明顯延長，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.基于動物肺癌模型NF-κB、COX2、STAT3、GRP78在支氣管上皮惡性轉(zhuǎn)化的作用研究
　　成功構(gòu)建了大鼠COPD模型和肺鱗癌模型，研究發(fā)現(xiàn)COPD大鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞分類較對照組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，COPD大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)白細(xì)胞總數(shù)和中性粒細(xì)胞均明顯增高(P＜0.01)，單核-巨噬

13、細(xì)胞所占比例明顯降低(P＜0.01);經(jīng)過肺癌造模后發(fā)現(xiàn)COPD+致癌組肺癌發(fā)生率(85.7％)較單純肺癌組(30.0％)高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);COPD+NF-κB抑制+致癌組肺癌發(fā)生率(22.2％)較COPD+致癌組(85.7％)低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);COPD+COX2抑制+致癌組肺癌發(fā)生率(25.0％)較COPD+致癌組(85.7％)低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);COPD+STAT3抑制

14、+致癌組肺癌發(fā)生率(30.0％)較COPD+致癌組(85.7％)低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);COPD+GRP78抑制+致癌組肺癌發(fā)生率(30.0％)較COPD+致癌組(85.7％)低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.本研究篩選出NF-κB、COX2、STAT3、GRP78及其相關(guān)的因子IKKβ、IκBα、IRE1α、XBP1、CyclinD1為參與COPD向肺鱗癌轉(zhuǎn)化的可疑炎癥因子。

15、r>　　2.長期低劑量CSE暴露可以導(dǎo)致重度吸煙COPD患者支氣管上皮細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，其中ROS以及相關(guān)的GRP78、NF-κB以及PI3K分子通路是惡性轉(zhuǎn)化的主要分子機(jī)制，這為吸煙相關(guān)的肺癌防治提供了一個新的靶點。
　　3.基于仿生肺芯片惡性轉(zhuǎn)化模型發(fā)現(xiàn)，NF-kB、STAT3、COX2、GRP78是支氣管上皮細(xì)胞炎癥惡性轉(zhuǎn)化中的關(guān)鍵節(jié)點，而TNF-α或IL-1β/NF-kB，IL-6/STAT3，COX2/ERK，GRP78